腦缺血模型大鼠腦組織Slit2蛋白表達與血管新生的相關性

陳方方 胡 霞

(新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院神經內科，新疆 烏魯木齊 830011)

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腦缺血模型大鼠腦組織Slit2蛋白表達與血管新生的相關性

陳方方 胡 霞

(新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院神經內科，新疆 烏魯木齊 830011)

目的 探討大鼠腦缺血后Slit2同源物2(Slit2)蛋白與血管新生的相關性。方法 將36只SD雄性大鼠隨機分為假手術組、模型1 d組和模型3 d組，每組12只。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型，并于第1、3天分別進行行為學評分。取腦組織，采用Western印跡方法檢測缺血腦組織中Slit2及其受體Robo1蛋白以及血管內皮生長因子(VEGF)的表達。利用CD50標記大鼠新生血管內皮細胞，計數(shù)新生血管密度(MVD)。結果 模型組大鼠缺血腦組織中Slit2蛋白、VEGF的表達以及MVD均明顯高于假手術組(P<0.01)，且在模型1 d組和模型3 d組中Slit2蛋白、VEGF的表達和MVD均明顯升高；而與假手術組相比，Robo1的表達也在造模第1天顯著升高(P<0.01)，但第3天其表達卻出現(xiàn)下降，但仍明顯高于假手術組(P<0.01)。Pearson相關性分析發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦組織中Slit2蛋白的表達與VEGF及MVD呈正相關(r=0.981、0.944，P<0.01)。結論 在腦缺血模型大鼠腦組織中Slit2蛋白的表達升高，推測Slit2蛋白可能與大鼠腦缺血后血管的新生密切相關。

腦缺血；Slit2蛋白；血管新生

腦缺血發(fā)生后，缺血區(qū)域通過加快新生血管的形成改善局部腦血流供應進而挽救缺血半暗帶內瀕臨死亡的神經細胞，促進神經功能的恢復，對腦缺血的預后發(fā)揮重要作用。Slit2同源物2(Slit2)蛋白是由神經系統(tǒng)中線的神經細胞分泌的一種糖蛋白，是Robo1蛋白配體〔1,2〕。研究發(fā)現(xiàn)〔3～5〕，Slit2/Robo1信號通路可能通過導向血管內皮頂端細胞的遷移影響新生血管的分支與延伸，在血管的形成過程中發(fā)揮重要的作用，與腫瘤以及各種組織的血管新生也存在密切聯(lián)系。本文通過檢測Slit2，Robo1，血管內皮生長因子(VEGF)的表達以及新生血管密度(MVD)，探討腦缺血模型中Slit2蛋白表達與血管新生的關聯(lián)并推測其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年雄性SD大鼠36只，7周齡，體重250～280 g，平均268 g，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。動物合格編號SCXK(豫)2015-0012。

1.2 模型制備及行為學評分 采用線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型。10%水合氯醛麻醉大鼠，沿頸正中部行3～4 cm的切口，鈍性分離肌肉，暴露頸總動脈以及頸內、頸外動脈并分離，結扎頸外動脈，在距離頸內、頸外動脈分叉2 cm處剪一小口，并輕輕插入線栓，直至遇到阻力為止，結扎固定線栓，縫合切口。術后2 h后根據(jù)Longa〔6〕評分法對大鼠進行行為學評分，1～3分為合格，納入實驗。評分為0和4分的剔除實驗。

將36只大鼠隨機分為假手術組、模型1 d組和模型3 d組，每組12只，假手術組除不插線外，其余操作同模型組，分別于術后第1天和第3天頸椎脫臼處死大鼠。

1.3 Western印跡檢測缺血腦組織中Slit2、Robo1以及VEGF的表達 取損傷區(qū)的腦組織，剪碎，加入裂解液，置冰上勻漿并4℃裂解30 min，14 000 r/min離心5 min，取上清凍存。用二甲基喹啉(BCA)法測定蛋白濃度，取適量上清，加入十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，煮沸5 min，在100 V電壓下電泳2 h，轉至聚偏氟丙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗3次加入二抗孵育1 h，電化學發(fā)光顯影定影。采用Bandscan5.0軟件進行灰度值分析，Slit2、Robo1以及VEGF蛋白的灰度值與內參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)灰度值的比值作為目的蛋白的表達水平。

1.4 MVD的檢測 大鼠麻醉后，經心臟灌注生理鹽水，待兩側上肢和肺部變白后，再用4%多聚甲醛灌注至雙上肢僵硬，取出腦組織，并置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋并切片。切片脫蠟水化后，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗(5 min，3次)，抗原修復15 min，37℃血清封閉0.5 h后加一抗(CD50)，4℃孵育過夜，加二抗37℃孵育30 min，加鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)37℃溫箱孵育30 min后，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，脫水，封片。鏡下觀察并參照Weidner 等〔7〕的方法進行微血管計數(shù):在低倍視野下找到血管密度最高處，再在400倍視野下，以呈棕色單個內皮細胞或內皮細胞簇且與鄰近的微血管或其他結締組織分開者為一個微血管，在熱點處選取4 個不同區(qū)域進行微血管計數(shù)，計算MVD，單位為個/視野。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0軟件，采用單因素方差分析和t檢驗比較各組大鼠缺血腦組織中Slit2蛋白、VEGF和Robo1的表達以及MVD；相關性用Pearson軟件進行分析。

2 結 果

2.1 Slit2蛋白的表達 模型組缺血腦組織中Slit2蛋白的表達顯著高于假手術組(P<0.05)，且模型3 d組Slit2蛋白的表達較模型1 d組明顯升高(P<0.01)。見表1，圖1。

2.2 Robo1蛋白的表達 與假手術組比，模型1 d組和模型3 d組中Robo1蛋白的表達均明顯升高(P<0.01)，術后第1天升高最為顯著(P<0.05)，然而第3天后其表達卻下降明顯。見表1，圖2。

2.3 VEGF的表達 模型1 d組和模型3 d組的大鼠腦缺血組織中VEGF的表達均高于假手術組(P<0.01)，GAPDH作為內參照，見表1，圖3。

2.4 各指標相關性分析 Slit2蛋白的表達與VEGF、MVD具有顯著的正相關(r=0.981、0.944，P<0.01)。

表1 大鼠缺血腦組織中各指標比較±s,n=12)

與假手術組比較:1)P<0.05，與模型1 d組比較：2)P<0.01

圖1 Slit2蛋白在腦缺血組織中的表達

圖2 Robo1蛋白在腦缺血組織中的表達

圖3 VEGF在腦缺血組織中的表達

3 討 論

Slit/Robo信號通路可以通過充當一些軸突的導向抑制因子或軸突支化和延長誘導因子在細胞遷移、炎性反應、腫瘤發(fā)生及器官發(fā)育等方面發(fā)揮重要調控作用〔8～10〕。Wang 等〔11〕首次提出，Slit2蛋白作為誘導劑在體內通過與人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)上與Robo1受體特異性結合，促進內皮細胞的定向遷移和血管形成。后來通過R5阻斷Robo1在雞胚尿囊絨膜血管生成實驗證明Slit2/Robo1對新生血管的形成是必不可少的，內皮細胞在血管生成刺激物的刺激下可以生成新的血管，如在VEGF等刺激下內皮細胞發(fā)生定向遷移，游走并聚合于血管生成刺激因子區(qū)域，形成管腔結構逐漸形成血管網。在子宮內膜異位癥的相關研究中，學者們也發(fā)現(xiàn)Slit2 蛋白過表達能夠增加微血管密度和病變大小〔12〕。Rama 等〔13〕通過敲除小鼠Slit 及Robo 蛋白的各亞型，發(fā)現(xiàn)Slit2可以選擇性地結合Robo1 和Robo2受體進而誘發(fā)新生小鼠視網膜及眼部新生血管性疾病。Jones 等〔14〕通過細胞生物學和生物化學技術發(fā)現(xiàn)，Slit2 通過細胞表面形成的Robo4-paxillin復合體阻斷胞內Arf6 的激活，抑制脈絡膜和視網膜血管疾病病理性血管生成。報道指出，EphA2缺陷的內皮細胞Slit2 蛋白表達升高，抑制Slit2 蛋白活性可以促進體內以及體外培養(yǎng)細胞中VEGF 誘導的血管生成〔15〕。但Altay等〔16〕通過TNFα誘導小鼠腦缺血和全心缺血模型，在對Slit蛋白調節(jié)腦血管炎癥的研究中指出內源性Slit蛋白腦血管炎癥應答反應起負調控作用；而外源Slit通過降低大腦微循環(huán)中細胞因子及局部缺血誘導的白細胞的募集反應參與調節(jié)腦血管炎癥反應。

Robo1作為Slit2蛋白受體，VEGF作為誘導新生血管產生的最主要細胞因子，MVD可直接代表血管新生程度。本研究提示Slit2蛋白與缺血腦組織的血管新生密切相關，推測可能是Slit2蛋白通過增加VEGF的表達從而間接增強缺血腦組織的血管新生，或者是Slit2蛋白協(xié)同VEGF直接參與缺血腦組織的血管新生進程。模型組在造模第1天Robo1的表達急劇升高，這可能與細胞受損后的應激以及Robo1介導的炎癥細胞趨化黏附有關；而在第3天時Robo1的表達有所下降，但仍高于假手術組，可能是隨著缺血腦組織炎癥反應的緩和使得Robo1的表達水平下降，但Slit2蛋白表達升高仍需要高水平的Robo1來發(fā)揮Slit2蛋白介導的血管新生作用。

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〔2016-03-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

陳方方(1977-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病方面的研究。

R743

A

1005-9202(2016)19-4719-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.021