人源DNA錯配修復基因和微衛星不穩定與老年結腸癌的相關性

郝東明 李 麗 楊景文

(天津市人民醫院肛腸外科，天津 300121)

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人源DNA錯配修復基因和微衛星不穩定與老年結腸癌的相關性

郝東明 李 麗 楊景文

(天津市人民醫院肛腸外科，天津 300121)

目的 探討老年結腸癌患者腫瘤組織的人源DNA錯配修復基因(hMLH)1和微衛星不穩定性型情況。方法 通過甲基化特異性聚合酶鏈反應(PCR)檢測老年結腸癌樣本中基因hMLH1啟動子甲基化修飾的異常；研究結腸癌樣本中微衛星標志物雜合型丟失頻率；確定結腸癌患者中的變異與結腸癌的相關性。結果 18.0%的老年結腸癌樣本中出現hMLH1啟動子高甲基化；51.2%出現微衛星標記D22S280或D22S929的雜合型缺失，25.6%出現D22S280和D22S929的雜合型缺失，并且雜合型缺失與基因hMLH1啟動子高甲基化狀態相互獨立。基因hMLH1啟動子甲基化可作為獨立的變量預測腫瘤的預后。結論 根據hMLH1啟動子甲基化狀態對高甲基化狀態結腸癌進行分類，基因 hMLH1可作為微衛星不穩定型老年結腸癌潛在預后標志物之一。

結腸癌;微衛星不穩定;人源DNA錯配修復(hMLH)1;啟動子甲基化;甲基化特異性聚合酶鏈反應(PCR)

結腸癌發展的遺傳學機制主要包括以下三類：染色體不穩定性(CIN)、微衛星不穩定性(MSI)及甲基化〔1〕。但是，結腸癌遺傳變異在臨床表型方面尚不清楚。上述三種機制都表現為突變的積累，然而每一種機制都涉及不同的基因，從而表現出不同的臨床病理特征。而且，上述三種結腸癌的發生機制可能會同時發生，從而具有不同的預后〔2〕。基因啟動子區域的超甲基化可沉默基因表達，在癌癥的發生中起到重要作用〔3〕。通過候選基因甲基化分析，對腫瘤進行分類，分析的效能與所選用的候選基因及候選基因的數目相關。在已有的候選基因分析中，都包括人源DNA錯配修復基因(hMLH)1，其在癌癥發生中主要因被表觀修飾失活〔4〕。hMLH1的編碼蛋白參與DNA復制復合體的組成〔4〕。hMLH1啟動子甲基化異常是散發型MSI結腸癌主要發病機制〔4〕。hMLH1啟動子甲基化高頻出現于結腸癌樣本中，與多個腫瘤分子標志物(如hMLH1表達和MSI及腫瘤臨床病理表型(腫瘤患者的性別、腫瘤部位、腫瘤分期)相關〔5〕。因此,hMLH1啟動子甲基化是散發型結腸癌甲基化修飾子表型的主要分子標志物。BRAF蛋白在Ras/Raf/MEK/ERK信號通路中主要介導細胞生長信號。其中，BRAF(V600E)在結腸癌中高頻出現10%～20%，現已證明BRAF(V600E)與錯配修復機制(MMR)缺陷相關〔6〕。此外，BRAF基因變異與MSI相關〔7〕。微衛星不穩定型腫瘤特有的臨床病理特征表現為近端腫瘤、高齡、黏液樣病理特征，并且侵襲性稍弱〔6〕。本研究對老年結腸癌樣本嘗試基因分型，并且結合臨床預后的數據鑒定與預后相關的分子標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 我院2010年9月至2014年6月48例結腸癌樣本及5例正常樣本。患者均知情同意并得到本院倫理委員會的批準。典型結腸癌20例，非典型結腸癌16例和退變型結腸癌12例。年齡≥60歲，平均(66.04 ±4.57)歲，男女性別比為2.33∶1。其中43例以血液來源的樣本作為配對的正常樣本。所有患者無遺傳病史及其他腫瘤病史。冰凍組織及血液樣本經蛋白酶K處理后抽提基因組DNA。

1.2 DNA重亞硫酸鹽修飾 DNA中未甲基化的胞嘧啶經修飾變為尿嘧啶，隨后用甲基化及非甲基化特異性的引物進行擴增。5 μg DNA按照CpG基因組DNA修飾試劑盒的說明書進行修飾，并溶于25 ml溶解緩沖液。

1.3 甲基化特異性聚合酶鏈反應(PCR)檢測 用于鑒定hMLH1非甲基化的引物為5 -TTT TGA TGT AGA TGT TTT ATT AGG GTT GT-3 (正向)和5 -ACC ACC TCA TCA TAA CTA CCC ACA-3(反向)；鑒定hMLH1甲基化的引物為5 -ACG TAG ACG TTT TAT TAG GGT CGC-3(正向) 和5 -CCT CAT CGT AAC TAC CCG CG-3(反向)。PCR反應體系：50 ng重亞硫酸修飾的DNA,0.3 mmol/L引物，0.2 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2,1×PCR 緩沖液和0.4 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶。反應條件:95℃ 10 min，(94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 50 s,循環34次),72℃ 10 min。5 μl樣品用于電泳檢測。所有PCR反應以CpGenome通用DNA為陽性對照，同時設置相應陰性對照。

1.4 微衛星分析 所選用的微衛星標志為BAT25,BAT26,D2S123,D5s346,D17S250,humAR,CTT16,D19S210和DHFRP2。MSI根據重復的核苷酸數目進行分類。目前，單核苷酸重復標志BAT25,BAT26分別位于基因MSH2的第5個內含子和癌基因c-Kit的第16個內含子；二核苷酸重復標志物D2S123(chr2:51288467-51288646),D5S346(chr5:112213624-112213748),D17S250(17:37152092-37152243)是結腸癌MSI分析中最常用到的微衛星標志。這5個微衛星標志即為Bethesda標志，已得到眾多研究的驗證。除此之外，為了增加微衛星檢測的靈敏性，還引入幾個最近鑒定出的微衛星標志物humAR、CTT16(chr11:40651848-40652024)、D19S210(chr19:57019539-57019883) 和DHFRP2。除了微衛星標記，使用兩個多態性標記(D22S280和D22S929)進行雜合型丟失分析。引物5'端經過HEX和FAM熒光標記。PCR反應體系(20 μl基因組DNA 50 ng):0.3 mmol/L引物，0.2 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2,1×PCR 緩沖液Ⅱ和0.4 U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems)，PCR反應條件:95℃ 10 min(94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 50 s,循環34次),72℃ 10 min。

MSI的存在與否按照已有的定義進行鑒定，LOH則通過半定量分析等位基因不穩定性QLOH =(t1/t2)/(n1/n2)、t1、t2、n1、n2分別是腫瘤樣本和正常樣本的兩個等位基因的峰值。當QLOH遠大于1時表示雜合型獲得；QLOH為0和1分別表示雜合型完全丟失及雜合型保留；QLOH<0.4表示檢測到雜合型丟失。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行χ2檢驗和Pearson相關性檢驗。

2 結 果

2.1 甲基化分析 正常樣本未發生甲基化，但是18%的腫瘤樣本表現出hMLH1啟動子高甲基化。其中hMLH1啟動子高甲基化在典型結腸癌、非典型結腸癌及退行性結腸癌中發生的比例分別為5.0%(1/20),12.5%(2/16)，50.0%(6/12)。hMLH1啟動子高甲基化與結腸癌的分型具有顯著相關性(P=0.014)，見圖1，表1。

表1 樣本甲基化特異性PCR(MSP)和微衛星分析的結果

續表1 樣本甲基化特異性PCR(MSP)和微衛星分析的結果

M：甲基化；-：未甲基化；L:雜合型丟失；R：雜合型保持；NI：沒有信息；ND：未分析

PCR條帶的出現與否即代表這個樣本中是否存在相應的等位基因；U:未甲基化修飾；M:甲基化修飾圖1 結腸癌患者hMLH1甲基化特異性PCR結果

2.2 微衛星分析 對43對結腸癌樣本(具有配對的血液來源的正常樣本)，包括典型結腸癌15例、非典型結腸癌14例和退行性結腸癌12例進行微衛星分析。選用結腸癌樣本中已知的9個微衛星標記進行分析，發現樣本M28在D17S250,CTT16和DHFRP2出現了MSI，但是樣本M28并未發生基因hMLH1啟動子甲基化；樣本M31在D19s210出現MSI,并且發生了基因hMLH1啟動子的甲基化，見圖2，表1。部分樣本的MSI獨立于hMLH1啟動子的甲基化，可能由于腫瘤患者群體的異質性。腫瘤的發生是多步驟多因素的，因此，這部分樣本可能存在其他hMLH1功能丟失的機制，如基因突變、基因拷貝數改變等。數據挖掘發現基因hMLH1 在腫瘤中有超過20%的功能丟失性突變。同義突變并不影響hMLH1編碼產物只占其突變總數的(13.04%)，其他的突變類型包括無義突變11.07%、錯義突變57.31%、移碼插入突變3.17%、非移碼插入突變1.97%、移碼缺失突變9.89%及其他突變3.56%；其中移碼突變和無義突變極可能導致基因功能丟失，超過突變總數20%。

箭頭所示為甲基化等位基因圖2 2例結腸癌樣本在4個位點出現MSI

2.3 雜合型丟失分析 腫瘤的發生中涉及癌基因突變通常會出現二次打擊事件。其中雜合型丟失即為其中一種。上述43對結腸癌樣本中進行D22S280和D22S929的雜合型丟失分析，結果顯示D22S280和D22S929至少有一個可以有效顯示雜合型狀態。同時，51.2%(22/43)的樣本至少出現一個標記(D22S280或 D22S929)雜合型丟失，25.6%(11/43)的樣本出現標記D22S929和D22S280雜合型丟失。其中典型性結腸癌、非典型性結腸癌及退行性結腸癌出現雜合型丟失的比例分別為40.0%，50.0%，64.3%。樣本M28在D22S280表現出雜合型丟失。雜合型丟失與染色體22q及結腸癌的分類沒有顯著相關性，并且雜合型丟失與基因hMLH1甲基化無相關性(P>0.05)，見圖3，表1。結腸癌患者中微衛星標志物D22S280和D22S929雜合型丟失事件是獨立于基因hMLH1甲基化。

雜合型丟失箭頭所示圖3 染色體22q兩個標記的雜合型丟失

3 討 論

MSI最先在結腸癌中發現，在其他腫瘤中也有報道〔8〕。除此之外，染色體不穩定性及基因啟動子甲基化異常也能導致結腸癌發生〔9〕。癌癥基因組研究計劃通過分析MSI及hMLH1啟動子高甲基化結腸癌所累及的基因，發現高頻突變腫瘤與MSI-H的腫瘤表型很相似，具有CIN的結腸癌與甲基化表型結腸癌表型也有部分相似，其中MMR變異主要在MSI腫瘤中發揮作用。hMLH1啟動子高甲基化則表現為基因表達水平的降低，從而導致功能的缺失〔1〕。數據顯示在所有結腸癌樣本中，基因hMLH1發生改變的頻率為25%〔3〕，而在MSI亞群中，基因hMLH1發生改變的頻率上升為33%〔10〕。因此，基因hMLH1甲基化水平的改變可能早于MSI事件的發生。

本研究發現有些樣本出現MSI表型可能是伴隨著基因hMLH1啟動子的超甲基化。然而，部分樣本的MSI表型獨立于基因hMLH1啟動子甲基化水平的異常；這可能是由于患者之間的異質性，或是存在其他可能影響到DNA復制修復基因的功能丟失?；騢MLH1還與近端定位、低分化及基因BRAF的突變存在相關性，并且基因hMLH1的變異在年長患者中較高頻出現，臨床病理特征與高甲基化腫瘤臨床病理特征表現出來的特征一致〔11〕，在含基因hMLH1變異的腫瘤也表現出高甲基化腫瘤的特征。因此，基因hMLH1可以作為區分高甲基化腫瘤的一個新的特征。在遠端腫瘤中，基因hMLH1的變異與預后呈負相關〔12〕。另外，結腸癌甲基化方式的不同對預后的影響也不同〔13〕。已有研究表明，通過甲基化狀態進行預后預測的效果隨著選用甲基化標記的數目增加而增加〔14〕。hMLH1是無病生存率(DFS)的強預后因子，但是也有人發現甲基化與預后好的關聯性只在結腸癌二期及三期中出現〔15〕。但是，同時具有hMLH1和MSI的腫瘤患者預后較差。根據MSI和甲基化狀態對腫瘤進行分類可以有效反映細胞的遺傳及表觀遺傳狀態。因此以hMLH1狀態對腫瘤進行分類，可以得到DFS預后較好的一類腫瘤。綜上，MSI可以作為進一步區分基因hMLH1高甲基化腫瘤的標志。通過結合MSI及hMLH1高甲基化的特征對腫瘤進行精確分型更加有助于臨床治療和預后。

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〔2015-02-25修回〕

(編輯 苑云杰)

天津市衛生局科技基金(No.2012KY20)

楊景文(1981-)，男，博士，主治醫師，主要從事結直腸腫瘤研究。

郝東明(1978-),男,碩士,主治醫師,主要從事結直腸腫瘤研究。

R735.3

A

1005-9202(2016)20-4947-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.004