非甾體抗炎藥對(duì)腦缺血再灌注時(shí)大腦腦組織鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶與環(huán)氧化酶表達(dá)的影響

孫曉玲

(哈勵(lì)遜國際醫(yī)院病理科，河北 衡水 053800)

?

非甾體抗炎藥對(duì)腦缺血再灌注時(shí)大腦腦組織鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶與環(huán)氧化酶表達(dá)的影響

孫曉玲

(哈勵(lì)遜國際醫(yī)院病理科，河北 衡水 053800)

目的 觀察大鼠腦缺血/再灌注損傷(CI/RI)24 h和72 h腦組織鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)、環(huán)氧化酶(COX)-1和COX-2的分布及非甾體抗炎藥阿司匹林和羅非昔布的影響。方法 雄性SD大鼠，線栓法制作右側(cè)局部大腦中動(dòng)脈缺血2 h、再灌注24 h或72 h模型。分為假手術(shù)組、溶媒組、阿司匹林(50 mg/kg)組和羅非昔布2 mg/kg組。TTC染色法觀察腦損傷面積；免疫組化法測(cè)定CaN 、COX-1和COX-2表達(dá)，高倍視野(×400)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目。結(jié)果 ①與CI/RI 24 h相比，CI/RI 72 h腦損傷面積減小，阿司匹林和羅非昔布均有明顯的保護(hù)作用。②CaN表達(dá)：CI/RI 24 h和72 h，CaN表達(dá)減少；阿司匹林明顯提高兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，而羅非昔布沒有明顯效果。③COX-1表達(dá)：CI/RI 24 h和72 h，COX-1表達(dá)沒有明顯變化，阿司匹林和羅非昔布對(duì)其沒有明顯影響。④COX-2表達(dá)：CI/RI 24 h和72 h，COX-2表達(dá)明顯增強(qiáng)，阿司匹林和羅非昔布明顯降低其表達(dá)，2組間無顯著差異。結(jié)論 腦缺血/再灌注時(shí)CaN 、COX-1和COX-2在腦組織的陽性表達(dá)無明顯一致性；CaN可能是阿司匹林神經(jīng)保護(hù)作用的新靶點(diǎn)。

腦缺血/再灌注；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶；環(huán)氧化酶；阿司匹林；羅非昔布

腦缺血/再灌注損傷(CI/RI)是一個(gè)多環(huán)節(jié)復(fù)雜的病理過程，其損傷機(jī)制尚不十分清楚。阿司匹林和羅非昔布作為非甾體類抗炎藥，對(duì)CI/RI的腦保護(hù)作用及機(jī)制已有報(bào)道〔1～4〕。有研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林對(duì)CI/RI時(shí)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)活性有明顯影響，其影響途徑和機(jī)制尚不清楚〔5，6〕。環(huán)氧化酶(COX)-1和COX-2作為非甾體類抗炎藥物常見的作用靶點(diǎn)，阿司匹林對(duì)CaN活性的影響是否與COX有關(guān)，尚未見報(bào)道。本文觀察大鼠CI/RI 24 h和72 h腦組織CaN、COX-1和COX-2的分布及非甾體抗炎藥對(duì)其的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 阿司匹林粉，Sigma 公司產(chǎn)品，以無水乙醇助溶(乙醇終濃度<0.5%)；羅非昔布由江南大學(xué)醫(yī)學(xué)院邱麗穎教授惠贈(zèng)；氯化三苯基四氮唑(TTC)，上?；瘜W(xué)試劑公司，磷酸鹽緩沖液配制，避光低溫貯存。CaN、COX-1和COX-2一抗購自武漢博士德生物有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 模型制備及分組 雄性SD大鼠，體重(250±10)g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(滬)2003-0003。術(shù)前12 h禁食，自由飲水。直徑0.205 mm、長(zhǎng)2.5 cm尼龍線作栓子，75%乙醇浸泡15 min，生理鹽水沖洗后置于1%肝素等滲鹽水中備用。8%水合氯醛400 mg/kg麻醉，參考邱麗穎等〔5〕腔內(nèi)線栓法制作右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞模型。按Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后評(píng)1～3分者為手術(shù)成功標(biāo)志。假手術(shù)組除不插入栓子，其余相同。缺血2 h麻醉狀態(tài)下拔出線栓行再灌24 h或72 h。隨機(jī)分成假手術(shù)組，溶媒組、阿司匹林組(50 mg/kg)和羅非昔布組(2 mg/kg)。再灌注同時(shí)灌胃給予溶媒或藥物一次。

1.3 腦損傷面積測(cè)定 再灌注24 h或72 h時(shí)迅速斷頭取腦，去除小腦和腦干，于冠狀位四刀五分切法切片，切片厚度約2 mm。將切片速置于2%TTC染液中，37℃避光孵育30 min，正常組織呈紅色，損傷組織呈白色。孵育后的腦片置于10%甲醛溶液中避光保存，7 d內(nèi)數(shù)碼相機(jī)拍照輸入計(jì)算機(jī)，AutoCAD軟件計(jì)算5個(gè)腦片10個(gè)平面的損傷面積和損傷側(cè)總面積，以損傷面積占該側(cè)大腦總面積的百分比作為損傷范圍的統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

1.4 腦組織免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 再灌注24 h或72 h時(shí)迅速斷頭取腦，取視交叉至漏斗柄的腦片，置10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm冠狀切片置于多聚賴氨酸處理的玻片，脫蠟至水。免疫組化SABC法測(cè)定CaN、COX-1和COX-2基因蛋白，嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。胞質(zhì)呈棕色顆粒的細(xì)胞為陽性表達(dá)細(xì)胞。每張切片在損傷區(qū)和內(nèi)周邊區(qū)各取5個(gè)高倍視野(10×40)，計(jì)數(shù)CaN、COX-1和COX-2陽性細(xì)胞數(shù)，最后取10個(gè)視野的平均數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 阿司匹林和羅非昔布對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)CI/RI大鼠腦損傷面積的影響 腦缺血/再灌注24 h時(shí)，溶媒組腦損傷面積為(25.32±2.21)%，與假手術(shù)組(0)比較有顯著差異(P<0.01)；再灌注72 h時(shí)腦損傷面積為(10.53±1.86)%，與24 h比較有顯著差異(P<0.01)。腦缺血/再灌注24 h，阿司匹林和羅非昔布組損傷面積分別為(0.94±0.08)%和(0.85±0.03)%，腦缺血/再灌注72 h，Asp和Rof損傷面積分別為(0.66±0.04)%和(0.71±0.05)%，都明顯縮小了損傷面積，與溶媒組相比均有顯著差異(P<0.01)。

2.2 阿司匹林和羅非昔布對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)CI/RI大鼠腦組織CaN表達(dá)的影響 腦缺血/再灌注24 h時(shí)，溶媒組CaN表達(dá)與假手術(shù)組比較顯著降低(P<0.01)；再灌注72 h與24 h比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。阿司匹林可明顯改善兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)CaN的表達(dá)(P<0.01)。羅非昔布對(duì)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的CaN的表達(dá)沒有明顯影響。見表1。

表1 阿司匹林和羅非昔布對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)CI/RI大鼠腦組織CaN表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與溶媒組比較：3)P<0.01

2.3 阿司匹林和羅非昔布對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)CI/RI大鼠腦組織COX-1表達(dá)的影響 腦缺血/再灌注24 h時(shí)，溶媒組COX-1表達(dá)與假手術(shù)組比較無顯著差異(P>0.05)；再灌注72 h與24 h相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。阿司匹林和羅非昔布對(duì)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)COX-1的表達(dá)均沒有明顯影響(P>0.05)。見表2。

表2 阿司匹林和羅非昔布對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)CI/RI大鼠腦組織COX-1表達(dá)的影響

2.4 阿司匹林和羅非昔布對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)CI/RI大鼠腦組織COX-2表達(dá)的影響 腦缺血/再灌注24 h時(shí)，溶媒組COX-2表達(dá)與假手術(shù)組相比顯著增加(P<0.01)；再灌注72 h與24 h相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。阿司匹林和羅非昔布可明顯改善兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)COX-2的表達(dá)，兩組藥物組間沒有明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 阿司匹林和羅非昔布對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)CI/RI大鼠腦組織COX-2表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與溶媒組比較：2)P<0.01

3 討 論

CI/RI的機(jī)制尚不十分清楚，目前認(rèn)為與腦能量代謝、興奮性氨基酸、細(xì)胞因子、黏附分子的表達(dá)等多種因素有關(guān)〔7〕。腦組織CaN 是目前發(fā)現(xiàn)體內(nèi)受Ca2+/CaM激活的唯一蛋白磷酸酶，其在腦缺血中的作用和重要地位也早已引起重視。閻力君等〔8〕報(bào)道，小鼠斷頭5 min后，胞質(zhì)CaN內(nèi)源性底物的磷酸化水平明顯降低，CaN 參與了缺血后腦內(nèi)蛋白磷酸化過程的調(diào)控。與Ca2+/CaM依賴的蛋白激酶和蛋白磷酸酶的作用失衡有關(guān)〔9〕。研究證實(shí)，蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化反應(yīng)的失衡是遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的主要原因，缺血后CaN獨(dú)特的時(shí)間依從性變化可能是其中的關(guān)鍵因素〔10〕。國內(nèi)有報(bào)道，缺血后急劇發(fā)生的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)磷酸化和去磷酸化的過程的嚴(yán)重失衡也可能是急性期神經(jīng)元損傷的主要原因之一，并認(rèn)為CaN含量的下降可以作為神經(jīng)細(xì)胞不可逆損傷的標(biāo)志〔11〕。COX-2參與了CI/RI。CaN和COX之間是否在CI/RI過程中存在相互關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究表明阿司匹林對(duì)CaN的作用與抑制COX-2關(guān)系不密切。CaN可能是阿司匹林作用的新靶點(diǎn)。

1 Qiu LY，Du B，Li Y，etal.Anti-apoptotic effects of aspirin following cerebral ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Neural Regen Res,2008；3(9)：979-84.

2 Qiu LY，Li Y，Yang ZY，etal.Changes in neuronal apoptosis and apoptosis modulatory factors in cerebral ischemia/reperfusion〔J〕.Neural Regen Res，2007；2(6)：344-9.

3 Qiu LY，Du B，Li Y，etal.The change of brain metabolism and the action of aspirin after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Physiol Acta，2012；64(s1)：206.

4 余 涓，邱麗穎，周 宇，等.腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)與羅非昔布的影響〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào)，2005；21(5)：572-5.

5 邱麗穎，楊志勇，杜 斌，等.腦缺血再灌注損傷大鼠重要臟器鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性變化及阿司匹林的干預(yù)作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2010；30(5)：640-2.

6 邱麗穎，余 涓，陳崇宏.阿司匹林抗腦缺血/再灌注損傷的作用及機(jī)制〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào)，2006；22(8)：972-5.

7 Baliga SS，Jaques-Robinson KM，Hadzimichalis NM，etal.Acetaminophen reduces mitochondrial dysfunction during early cerebral postischemic reperfusion in rats〔J〕.Brain Res，2010；1319(1)：142-5.

8 閻力君，魏 群.大鼠突觸體鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶內(nèi)源底物的研究〔J〕.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1997；29(5)：513-5.

9 Nagahiro S，Uno M，Sato K，etal.Pathophysiology and treatment of cerebral ischemia〔J〕.J Med Invest，1998；45(1-4)：57-70.

10 Aronowski J，Grotta JC，Strong R，etal.Interplay between the gamma ishamform of PKC and calcineurin in regulation of vulnerability to focal cerebral ischemia〔J〕.J Cere Blood Flow Metab，2000；20(2)：343-9.

11 湯 穎，蘇志強(qiáng)，趙 艷，等.大鼠局灶腦缺血后鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性和含量變化〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2003；20(1)：4446.

〔2015-03-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

孫曉玲(1983-)，女，碩士，主要從事病理診斷研究。

R74

A

1005-9202(2016)20-4969-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.012