有機酸對甘草呼吸代謝及甘草酸積累的影響

楊春寧，孫志蓉 ，曲繼旭，劉曉欣，劉文蘭，朱南南，程麗麗

(北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102)

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中 藥 研 究

有機酸對甘草呼吸代謝及甘草酸積累的影響

楊春寧，孫志蓉*，曲繼旭，劉曉欣，劉文蘭，朱南南，程麗麗

(北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102)

目的：研究丙酮酸和琥珀酸兩種有機酸對甘草呼吸代謝及甘草酸積累的影響，從生理學的角度探討呼吸作用與甘草酸積累之間的關系。方法：采用溶氧法測定甘草根系呼吸速率；蒽酮比色法測定可溶性糖和淀粉的含量；2,4-二硝基苯肼顯色法測定丙酮酸的含量；Elisa試劑盒法測定乙酰輔酶A的含量；高效液相色譜法測定甘草酸的含量。結果：丙酮酸和琥珀酸對甘草的呼吸代謝具有促進作用，其作用大小為：琥珀酸組>丙酮酸組>對照組；對呼吸底物可溶性糖和淀粉的影響為琥珀酸組比丙酮酸組和對照組具有更高的積累，分別是對照組的1.02倍和1.04倍，是丙酮酸組的1.15倍和1.04倍；對中間物質丙酮酸含量具有極顯著影響(P<0.01)，但對乙酰輔酶A的影響差異不顯著(P>0.05)；對甘草酸含量具有一定影響，丙酮酸組甘草酸含量高于其他兩組，分別為對照組和琥珀酸組的1.24倍和1.05倍。結論：有機酸能夠通過調節甘草根系呼吸作用強弱來調節甘草酸的合成積累。

甘草；呼吸代謝；丙酮酸；琥珀酸；甘草酸

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是常用大宗中藥材，廣泛應用于制藥工業及飲料、調味品、香煙、糖果等行業，因其需求量不斷增加，野生資源日益減少[1]，人工栽培甘草規模在逐漸擴大。但目前多數人工栽培甘草中甘草酸的含量達不到《中國藥典》規定的大于2%的要求[2]。在人工栽培甘草方面，雖然已經完成了甘草由野生到栽培的馴化工作，且人工栽培甘草的技術和方法也在不斷成熟和完善[3-6]，但目前影響甘草酸積累的相關機制尚不明確，甘草酸含量低的問題還沒有得到解決。植物的呼吸代謝是物質與能量代謝的重要途徑[7]，為次生物質的生成提供重要的中間物質和能量。乙酰輔酶A(CoA)是甘草酸合成的初始供體[8],其主要來源為呼吸作用中的糖酵解途徑。丙酮酸是細胞中無氧呼吸與有氧呼吸的重要中間產物，在有氧條件下，丙酮酸轉化為CoA進入三羧酸循環(TCA)，生成有機酸和NADH，丙酮酸還是呼吸作用的潛在調節因子，丙酮酸等α-酮酸能夠刺激交替氧化酶(AOX)活性增強[9]；琥珀酸是植物體內進行三羧酸循環的重要中間產物，有研究表明琥珀酸能夠影響植物體的呼吸速率[10]。目前有機酸對甘草根系呼吸作用及甘草酸積累影響方面的研究還未見報道。本文通過外源丙酮酸、琥珀酸處理，考察有機酸對甘草根系呼吸代謝和甘草酸積累的影響，探討甘草呼吸代謝與甘草酸積累的相關關系，為提高人工栽培甘草質量提供研究資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為甘草當年播種苗。種子由內蒙古伊克昭盟杭錦旗甘草公司提供。采用無土栽培法，高溫滅菌后，按蛭石：珍珠巖體積比為4:1的比例充分混勻，裝于塑料花盆中，盆高16 cm，盆外口直徑為25 cm，內口直徑為21 cm。將盆按照隨機數字法分好組后放入北京中醫藥大學培養室內，澆透水2天后，播種。當地上部分長至20 cm左右時開始間苗，每盆留苗20株。待甘草蘆頭直徑長至1.0 cm左右時開始進行有機酸處理，分別設置空白對照組，丙酮酸組和琥珀酸組3個處理組，丙酮酸組和琥珀酸組分別施以濃度均為8 mmol/L的丙酮酸鈉和琥珀酸溶液(溶液用鹽酸和NaOH溶液調pH值至7.5左右)，每7天澆1次，每次1800 mL，空白對照組以等量清水代替。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘草根系總呼吸強度的測定

分別在實驗處理后的第1 d、3 d、7 d、14 d和28 d時，人工氣候室內光照處理2 h后采集甘草，選擇甘草中上部主根，剪成長約1 mm左右根段，將其分成三個不同的對照組，每組含20個根段，每組將根段放入Yaxin-1151生物氧測定儀葉室內，用0.2 M的Tris填充整個葉室后，將氧電極插入葉室中開始進行測定。每個樣品測定4～5 min，每組至少5個平行。上述實驗過程在25℃空調房中進行。

1.2.2 甘草呼吸底物和中間物質含量的測量

可溶性糖和淀粉的含量測定采用蒽酮比色法[11]加以改進。丙酮酸含量測定采用2，4-二硝基苯肼顯色法[12]加以改進。乙酰輔酶A選用植物乙酰輔酶A(A-COA)Elisa 試劑盒進行測定。

1.2.3 甘草酸含量的測量

采用周香珍[13]的方法加以改進。

1.3 數據統計分析方法

采用EXCEL 2010進行數據錄入和圖表繪制。采用SPSS20.0軟件進行One-way ANOVA方差分析，Kruskal-Wallis H(K)非參數檢驗，LSD檢驗法進行多重比較。

2 結果

2.1 有機酸對甘草總呼吸強度的影響

有機酸處理后，甘草的根系呼吸產生相應的變化，如圖1所示。不同取樣時間各處理組甘草根系總呼吸差異較明顯，有機酸溶液處理后第1 d，各組甘草根系總呼吸速率顯著低于其他時間的測定值，第3 d時，各組處理組的呼吸速率明顯增大。處理第3 d、7 d、14 d和28 d測定的各組甘草根系呼吸值差異不大(P>0.05)。相同取樣時間各處理組間甘草根系總呼吸強度也不同，除第1 d外，各處理組間根系呼吸速率大小為：琥珀酸組>丙酮酸組>對照組。第1 d時，丙酮酸組>琥珀酸組>對照組。

圖1 丙酮酸、琥珀酸對甘草根系總呼吸速率的影響

2.2 有機酸對甘草呼吸底物、中間物質的影響

2.2.1 有機酸對甘草呼吸底物的影響

糖類通過呼吸代謝產生各種有機酸和能量，是根系呼吸的底物。由表1可見，丙酮酸處理組甘草根系的可溶性糖與對照組相比有所下降，是對照組的0.89倍；但淀粉含量與對照的1.08倍；琥珀酸處理組的可溶性糖和淀粉的含量均高于對照組，分別是是對照組的1.02倍和1.04倍。琥珀酸組甘草根系的可溶性糖和淀粉的含量分別為丙酮酸組1.15倍和1.04倍。各處理組甘草根系中可溶性糖和淀粉的含量沒有顯著性差異。

表1 不同處理組甘草呼吸代謝底物的含量及其方差分析±s)

2.2.2 對呼吸中間產物的影響

丙酮酸可以通過乙酰輔酶A和三羧酸循環實現生物體內糖、脂肪和氨基酸間的相互轉化。因此丙酮酸和乙酰輔酶A是參與整個生物體基本代謝的中間物質。丙酮酸和琥珀酸對甘草中間產物的影響如表2所示，不同處理組中丙酮酸和乙酶輔酶A含量有差異。各組間丙酮酸含量影響極顯著(P<0.01)，丙酮酸組最高，達到84.65 μg/g，是對照組甘草的1.12%；琥珀酸組甘草的丙酮酸含量最低，是空白組和丙酮酸組的90.29%和80.87%。各組間乙酰輔酶A含量差異不顯著(P>0.05)，丙酮酸組甘草中乙酶輔酶A含量較低，其含量為0.55 pmol/g，比對照組低14.54%；琥珀酸組甘草的乙酰輔酶A含量最高，為0.68 pmol/g，比對照組高0.05 pmol/g。

表2 不同處理組甘草中間產物的含量及其方差分析±s)

2.3 有機酸對甘草酸含量的影響

各處理組甘草中甘草酸含量有差異。丙酮酸組甘草酸含量高于其它兩組，分別為對照組和琥珀酸組的1.24倍和1.05倍。與對照組相比，琥珀酸組甘草根系中甘草酸含量略低，為0.240%，是對照組的0.97倍(見表3)。

表3 不同處理組甘草甘草酸含量及其方差分析表±s)

3 結論

植物在呼吸代謝中能夠產生多種有機酸，丙酮酸和琥珀酸均是參與三羧酸循環(TCA)的重要中間物質，并對植物體的呼吸具有很強的刺激作用[10]。施加外源丙酮酸和琥珀酸能夠對甘草的根系呼吸產生促進作用：除第1 d外，琥珀酸組甘草的根系總呼吸最強，其次為丙酮酸組，對照組的甘草根呼吸值最小，并且琥珀酸的呼吸作用大于丙酮酸，這與TCA在呼吸作用的所占有較大比例[14]具有一致性。丙酮酸和琥珀酸處理影響了甘草根系總呼吸速率，對比相同取樣時間(除第1 d外)，各組間差異趨勢基本一致：琥珀酸組甘草的根系總呼吸最強，其次為丙酮酸組，對照組的甘草根呼吸值最小。說明這兩種有機酸對甘草根系總呼吸具有促進作用。

丙酮酸和琥珀酸可以影響甘草根系的呼吸底物和中間物質含量，對呼吸底物具體的影響為：可溶性糖含量丙酮酸組最低，琥珀酸組含量最高，分別為對照組的0.89倍和1.02倍；淀粉含量丙酮酸組和琥珀酸組均高于對照組，分別是對照組的1.06倍和1.12倍。說明加入丙酮酸可以增加可溶性糖的消耗，加入琥珀酸能夠增加糖類的積累。丙酮酸處理顯著提高甘草根系中丙酮酸的含量，使乙酶輔酶A含量降低；琥珀酸處理使甘草根系中丙酮酸的含量減少，乙酶輔酶A含量升高。丙酮酸處理組丙酮酸含量差異極顯著(P<0.01),且其含量最多為84.65 μg/g，但乙酰輔酶A的含量卻最低為0.55 μg/g。

有機酸對甘草酸含量的影響丙酮酸組甘草酸含量高于其他兩組，分別為對照組和琥珀酸組的1.24倍和1.05倍。與對照組相比，琥珀酸組甘草根系中甘草酸含量略低，是對照組的0.97倍。在有氧條件下，丙酮酸分別經丙酮酸脫氫酶復合體和丙酮酸羧化酶作用下催化形成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A與草酰乙酸結合進入三羧酸循環。本試驗結果顯示，與其他兩組相比，丙酮酸處理組三羧酸循環增強，乙酰輔酶A含量降低，說明丙酮酸處理在提高甘草根系中丙酮酸含量的同時增強了三羧酸循環，乙酰輔酶A消耗加快導致自身含量降低。同時，丙酮酸組甘草酸含量比其他組含量高，說明乙酶輔酶A作為甘草酸合成的初始供體，由于處在代謝的“分支點”，其含量高低對甘草酸積累有影響。

綜上所述，有機酸可以通過調節甘草的呼吸作用強弱來調節初生物質與次生物質的代謝。但是有機酸影響甘草酸積累的機理目前還不清楚。三羧酸循環的強弱可以直觀的反映植物的呼吸耗氧，所以我們推測：有機酸對甘草酸積累的影響，很可能是通過影響甘草根系呼吸代謝中的三羧酸循環產生的。因為三羧酸循環一方面可以影響中間物質的代謝，另一方面可以影響植物的能量代謝。三羧酸循環是物質與能量的代謝中心，是根系呼吸代謝的重要樞紐，特別對以根和根莖類藥材的中藥活性物質的合成具有重要作用，期望通過進一步的試驗證實三羧酸循環與甘草酸的關系，為提高人工栽培甘草中甘草酸的含量提供理論依據。

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國家自然科學基金面上項目(No.81573524)

楊春寧(1990-)，男，北京中醫藥大學2014級碩士研究生，主要從事中藥材質量及調控機制研究工作。

孫志蓉*(1967-)，女，副教授，碩士研究生導師，主要從事中藥質量與開發研究工作。

2016-02-18

R28

A

1002-2406(2016)05-0001-03

修回日期：2016-03-01