雅連酒炙多糖成分轉(zhuǎn)化及免疫活性比較的研究

管勇舟，王秋紅，嚴(yán)光玉，匡海學(xué)*

(1.教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.洪雅縣瓦屋山藥業(yè)有限公司，四川 洪雅 620000)

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雅連酒炙多糖成分轉(zhuǎn)化及免疫活性比較的研究

管勇舟1，王秋紅1，嚴(yán)光玉2，匡海學(xué)1*

(1.教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.洪雅縣瓦屋山藥業(yè)有限公司，四川 洪雅 620000)

目的：研究雅連酒炙后多糖含量變化及免疫活性變化。方法：采用水提醇沉法提取多糖，苯酚硫酸法測定總多糖含量，Savag法除蛋白，體外ConA、LPS誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)測定多糖的免疫活性。結(jié)果：雅連炮制前后多糖含量依次為2.04%、1.32%；糖蛋白含量依次為1.52%、1.42%；糖醛酸含量依次為25.90%、33.27%；ConA、LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，炮制和未炮制雅連的多糖都具有抑制作用，炮制后雅連的多糖抑制作用增強(qiáng)；除蛋白后，炮制和未炮制雅連的多糖都具有免疫增強(qiáng)作用。結(jié)論：與糖結(jié)合蛋白和糖醛酸含量變化可能是酒炙雅連多糖免疫活性化的影響因素。

雅連；多糖；免疫活性

雅連又名峨眉連、嘉定連、刺蓋連，為植物三角葉黃連(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et H siao)的干燥根莖，為黃連藥典品種之一。 黃連始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，味苦，寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)[1]，具有清熱燥濕，瀉火解毒的功效。用于濕熱痞滿，目赤，黃疸，高熱神昏，心火亢盛等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究其具有抗菌[2-3]、神經(jīng)保護(hù)[4]、抗癌、降血糖[5-6]和改善心腦血管功能的作用[7-8]。歷代本草對黃連加工炮制方法的記載頗多，其中酒炙黃連可降低苦寒之性，是中藥炮制理論“相反為制”的典型代表。酒炙黃連還能引藥上行[9],善清頭目之火,用于目赤腫痛、口舌生瘡等。前期研究主要圍繞雅連小分子成分進(jìn)行指紋圖譜研究[10]，炮制前后小分子液質(zhì)分析[11]，但是雅連臨床用藥方式為水煎煮后服用，小分子溶出量較少，多糖成分卻在水煎煮中大量溶出，并伴隨患者用藥進(jìn)入人體。因此，為了闡明酒炙法對雅連多糖的影響，本實(shí)驗(yàn)研究了雅連酒炙前后多糖含量、蛋白含量、糖醛酸含量及免疫活性的變化。

1 儀器、試劑、藥材和動物

紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)；牛血清白蛋白(Sigma 公司)；ConA蛋白(Sigma 公司)；LPS脂多糖(Sigma 公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclong公司)；胎牛血清(美國Hyclong公司)；噻唑藍(lán)(MTT,Sigma公司)；黃酒(浙江省塔牌紹興酒有限公司)。雅連采購于四川省眉山市洪雅縣瓦屋山藥業(yè)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室蘇連杰教授鑒定為植物三角葉黃連(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)的干燥根莖。BALB/c小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，合格證號為SYXK黑2008001，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心提供。

2 方法

2.1 雅連的炮制

取一定量雅連藥材洗凈后，軟化切片，厚度約為1.5 mm，按藥材質(zhì)量：黃酒體積為8:1量取黃酒，用黃酒將雅連噴潤后，置于烘箱中，165℃烘烤20 min。

2.2 雅連多糖的制備

分別稱取50.0 g生品和酒炙雅連，用10倍量80%乙醇熱回流提取3次，每次2 h，再用10倍量的水熱回流提取3次，每次2 h，合并水提液，定容到1 L容量瓶中，苯酚-硫酸法[12]測定多糖含量。向水提液中加入95%乙醇溶液至上清液醇濃度為85%，4℃靜置24 h后雙層濾紙過濾，無水乙醇和丙酮交替洗滌沉淀至溶液無色。將沉淀水溶解，離心后過濾，截留分子量3500 D的透析袋后，濃縮，凍干得粗多糖。分別精密稱取一定量的粗多糖配成5%多糖溶液，采用Savag法[13]除蛋白。分別精密稱取10.0 mg多糖，用考馬斯亮藍(lán)法[14]測定多糖溶液蛋白含量。采用硫酸咔唑法[15-16]測定多糖糖醛酸含量。

2.3 雅連多糖免疫活性的測定

2.3.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞制備

取BALB/c小鼠4只。眼球放血后，頸椎脫臼處死，浸泡于75%酒精中。于超凈臺中無菌取脾，置于盛有PBS的培養(yǎng)皿中，研磨后過200目篩網(wǎng)，用PBS培養(yǎng)基沖洗，1000 r/min離心10 min，棄去上清液；加入5 mL預(yù)冷紅細(xì)胞裂解液，4℃裂解3 min，1000 r/min離心10 min；加6 mL完全培養(yǎng)基，混勻，用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個/mL。

2.3.2 炮制前后總多糖和脫蛋白后總多糖對小鼠脾細(xì)胞體外增殖的影響

2.3.2.1 對ConA誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞體外增殖影響

將制備的小鼠脾淋巴細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔加細(xì)胞懸液100 μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后除空白對照組外，其他組加入ConA使其終濃度為5 μg/mL，空白組加入等量的不完全培養(yǎng)液。置于37℃、5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后各給藥組每孔分別加入藥物20 μL，空白組和模型組加入等體積不完全培養(yǎng)液，37℃、5% CO2再培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入5 mg/mL MTT 50 μL，孵育4 h。小心吸除上清，再加入二甲基亞砜100 μL，于震蕩器上緩慢作用10 min，在酶標(biāo)儀上于492 nm處測吸光度(OD)值[17]。

2.3.2.2 對LPS誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞體外增殖影響

將制備的小鼠脾淋巴細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔加細(xì)胞懸液100 μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后除空白對照組外，其他組加入LPS使其終濃度為10 μg/mL，空白組加入等量的不完全培養(yǎng)液。置于37℃、5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后各給藥組每孔分別加入藥物20 μL，空白組和模型組加入等體積不完全培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2再培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入5 mg/mL MTT 50 μL，孵育4 h。小心吸除上清，再加入二甲基亞砜100 μL，于震蕩器上緩慢作用10 min，在酶標(biāo)儀上于492 nm處測吸光度(OD)值。

3 結(jié)果和分析

3.1 酒炙對雅連多糖含量的影響

按葡萄糖標(biāo)曲繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0098X-0.0133。測得生品雅連多糖含量為2.02%，酒炙雅連多糖含量為1.32%。說明酒炙后降低多糖得率，可能是加熱致使多糖降解的緣故。

3.2 酒炙對雅連多糖蛋白含量的影響

按蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0024X-0.0186。測得生品雅連多糖糖蛋白含量為2.59%，酒炙雅連多糖蛋白含量2.43%。除蛋白后，生品蛋白含量為0.86%，酒炙雅連蛋白含量為0.82%。說明多糖經(jīng)過酒炙后糖蛋白含量有所下降。

3.3 酒炙對雅連多糖糖醛酸含量的影響

按半乳糖醛酸標(biāo)曲繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=9.2628X+0.0283。測得生品雅連多糖糖醛酸含量為25.90%，酒炙雅連多糖糖醛酸含量為33.27%。說明炮制后雅連多糖糖醛酸含量升高。

3.4 酒炙對雅連多糖免疫活性的影響

對ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖結(jié)果見表1、圖1，生品雅連多糖和酒炙雅連多糖在一定濃度下對ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖均有抑制作用，且隨著濃度增加，抑制作用減弱；除蛋白后，生品雅連多糖對ConA誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖具有協(xié)同抑制作用，且隨多糖濃度增加協(xié)同作用減弱；酒炙雅連多糖對ConA誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖協(xié)同抑制作用增加，隨多糖濃度增加協(xié)同作用增強(qiáng)。

表1 多糖對ConA誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖影響

注：與ConA組相比，**P<0.01，*P<0.05；與空白組相比，△△P<0.01。

圖1 多糖對ConA誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖影響注：與ConA組相比，**P<0.01，*P<0.05；與空白組相比，△△P<0.01。

對LPS誘導(dǎo)的皮細(xì)胞增殖見表2、圖2，雅連生品多糖和酒炙雅連多糖對LPS誘導(dǎo)的脾細(xì)胞增殖均有抑制作用，且隨著多糖濃度增加抑制作用減弱；除蛋白后，生品雅連多糖對LPS誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖有協(xié)同抑制作用，隨濃度增加協(xié)同作用減弱；酒炙雅連多糖對LPS誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖有抑制作用。

表2 多糖對LPS誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖影響

注：與LPS組相比，**P<0.01，*P<0.05；與空白組相比，△△P<0.01。

圖2 多糖對LPS誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖影響注：與LPS組相比，**P<0.01，*P<0.05；與空白組相比，△△P<0.01。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用酒炙的炮制方法，研究炮制前后雅連多糖、多糖蛋白、多糖糖醛酸含量變化，同時研究了不同雅連炮制品多糖對ConA、LPS誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖影響。結(jié)果表明，酒炙后，雅連多糖、多糖蛋白及多糖糖醛酸得率均降低，可能是加熱使其降解所致。免疫細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，T、B淋巴細(xì)胞在機(jī)體特異性免疫發(fā)揮重要作用，其數(shù)量和活性影響機(jī)體免疫能力。T、B淋巴細(xì)胞又稱為免疫活性淋巴細(xì)胞，ConA是T淋巴細(xì)胞的促有絲分裂劑，LPS是B淋巴細(xì)胞的促有絲分裂劑。能夠和體外ConA或LPS誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖有協(xié)同抑制作用的藥物可能是T、B細(xì)胞免疫功能的促進(jìn)劑，相反則為抑制劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生品雅連多糖能夠抑制ConA、LPS誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖，酒炙雅連對ConA、LPS誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，推測其原因可能是酒炙后雅連多糖蛋白和糖醛酸含量變化引起多糖免疫活性變化所致；除蛋白后，生品雅連多糖和酒炙雅連多糖對ConA、LPS誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖有協(xié)同抑制作用，說明與糖結(jié)合的蛋白變化可能是雅連酒炙后多糖免疫活性物質(zhì)變化的物質(zhì)基礎(chǔ)。本文從多

糖角度，研究了雅連酒炙后多糖含量變化及其藥理活性變化，從免疫角度闡明雅連酒炙后多糖活性變化，為研究雅連酒炙的炮制的意義奠定了基礎(chǔ)，為今后揭示雅連酒炙后藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。

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國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81473351)；國家“973”課題項(xiàng)目(No.2013CB531801)

管勇舟(1990-)，男，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)在讀碩士，主要研究方向：中藥化學(xué)成分的研究。

匡海學(xué)*(1955-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ),中藥藥性理論研究工作。

2016-04-08

R285.5

A

1002-2406(2016)05-0012-03

修回日期：2016-05-01