益氣補腎活血方對佐劑關節炎大鼠JNK和P38MAPK的影響

劉家昌，孫燕妮，彭屹峰，劉淑清

(上海中醫藥大學附屬普陀醫院，上海 200062)

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益氣補腎活血方對佐劑關節炎大鼠JNK和P38MAPK的影響

劉家昌，孫燕妮，彭屹峰，劉淑清*

(上海中醫藥大學附屬普陀醫院，上海 200062)

目的：觀察益氣補腎活血方對佐劑關節炎大鼠滑膜JNK和P38MAPK的影響，探討益氣補腎活血方對類風濕關節炎的治療機制。方法：以雷公藤多苷作為對照，采用益氣補腎活血方對AA大鼠進行灌胃治療。觀測SD大鼠關節腫脹度，檢測滑膜JNK和P38MAPK的磷酸化表達水平。 結果：益氣補腎活血方不僅能明顯降低AA大鼠的關節腫脹度，又能明顯降低AA大鼠滑膜JNK和P38MAPK的磷酸化表達水平。結論：益氣補腎活血方能明顯緩解RA的臨床癥狀，該復方可能通過下調JNK和P38MAPK磷酸化表達水平，達到治療RA的目的。

類風濕關節炎；c-Jun氨基酸末端激酶；P38絲裂原活化蛋白激酶；佐劑關節炎大鼠；益氣補腎活血方；雷公藤多苷

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種系統性炎性疾病，該病發病初期的主要病變部位是關節滑膜。滑膜細胞信號特異性地調控關節滑膜的生理變化。異常的滑膜細胞信號轉導導致關節滑膜的病變，誘發RA，是其發病機制之一[1]。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑可介導細胞間及細胞內的多種生理病理反應過程，是生物體內重要的信號傳導系統[2]。c-Jun氨基酸末端激酶(JNK)和P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)途徑是MAPK途徑的重要組成部分。近年來的研究表明，RA的發病機制之一是JNK和P38MAPK途徑的異常激活[3-4]。本實驗以益氣補腎活血方干預治療AA大鼠，通過對治療前后JNK和P38MAPK表達水平的觀測，探討該復方對RA的療效及可能的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

健康5周齡雌性SD大鼠60只，體質量(160±20)g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。

1.2 藥物

益氣補腎活血方：由生黃芪，白芍，生白術，巴戟天，土鱉蟲，骨碎補等組成。雷公藤多苷片(遠大醫藥黃石飛云制藥有限公司，批號20140501)。

1.3 主要試劑及儀器

RIPA組織裂解液、麗春紅染色劑、BCA蛋白定量試劑盒、弗氏完全佐劑(FCA)、兔抗大鼠的JNK和P38MAPK抗體(美國Sigma公司)；電泳儀、自動酶標儀、離心機(德國Osterode公司)。

2 方法

2.1 動物分組及造模 見表1。

表1 動物分組及造模

2.2 給藥方法

給藥方式：灌胃。益氣補腎活血方按常規方法煎煮，并將藥物濃縮到不同濃度。各組所用藥物、濃度、數量、頻率、見表2。

表2 各組給藥方法

2.3 指標檢測

2.3.1 關節腫脹度(大鼠后足體積檢測)

采用排水法。

2.3.2 滑膜JNK和P38MAPK的磷酸化表達水平

運用免疫印跡法(WB)。

2.3.2.1 滑膜組織蛋白的提取及濃度測定

造模50天后，取大鼠關節滑膜組織，與組織裂解液混合、離心，提取蛋白；用BCA法測定蛋白濃度。

2.3.2.2 目的蛋白電泳與WB檢測 步驟見表3。

表3 目的蛋白電泳與WB檢測

2.4 統計學處理

3 結果

3.1 大鼠左后足體積變化

造模第1天，大鼠左后足體積組間比較無差異(P>0.05)；造模后第7～50天，大鼠左后足體積組間比較，各組均大于空白對照組，有統計學意義(P<0.01)；造模后第50天，大鼠左后足體積組間比較，各治療組均小于模型組，有統計學意義(P<0.01)；雷公藤組與中劑量中藥組比較，無顯著性差異(P>0.05)；各中藥治療組間比較，中劑量中藥組小于其他兩組，有顯著性差異(P<0.01)。見表4。

3.2 大鼠滑膜組織JNK的磷酸化表達

實驗結果顯示,實驗結束后，模型組大鼠滑膜JNK的磷酸化表達水平高于空白組，表明AA大鼠的JNK磷酸化表達高于空白組。各中藥治療組大鼠滑膜JNK的磷酸化表達水平均低于模型組，提示益氣補腎活血方可明顯降低JNK的磷酸化表達。中劑量中藥組的JNK磷酸化表達水平低于另外兩治療組，提示中劑量是抑制JNK磷酸化表達的最適劑量。見圖1、表5。

表4 各組大鼠左后足體積變化情況±s)

注：與模型組比較，aP<0.01,bP<0.05；與空白組比較，cP<0.01,dP<0.05；與中劑量中藥組比較，eP<0.01,fP<0.05。

圖1 各組大鼠滑膜組織JNK的磷酸化表達

3.3 大鼠滑膜組織P38MAPK的表達

實驗結果顯示：實驗結束后，模型組大鼠滑膜P38MAPK的磷酸化表達水平高于空白組，表明AA大鼠的P38MAPK磷酸化表達高于空白組。各中藥治療組大鼠滑膜P38MAPK的磷酸化表達水平均低于模型組，提示益氣補腎活血方可明顯降低P38MAPK的磷酸化表達。中劑量中藥組的P38MAPK磷酸化表達水平低于另外兩治療組，提示中劑量是抑制P38MAPK磷酸化表達的最適劑量。見圖2、表5。

圖2 各組大鼠滑膜組織P38MAPK的磷酸化表達

組別NJNKP38MAPK雷公藤組101.074ac0.861ac空白組100.881a0.629a中藥中劑量組101.129ac0.802ac中藥低劑量組101.693bce0.954ace中藥高劑量組101.753ce1.219ce模型組101.807c1.267c

注：與模型組比較，aP<0.01,bP<0.05；與空白組比較，cP<0.01,dP<0.05；與中劑量組比較，eP<0.01,fP<0.05。

4 討論

成纖維樣滑膜細胞是關節滑膜的重要組成部分，可以分泌作用于滑膜細胞信號轉導途徑的多種物質，如化學趨化因子、促炎性細胞因子等。上述物質分泌失衡，導致滑膜細胞信號轉導異常，引起關節滑膜的病理變化[5]。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑是廣泛存在于生物體內重要的信號傳導系統之一，可介導細胞間及細胞內的多種生理病理反應過程。目前研究已證實的MAPK途徑有4條，即C-Jun氨基末端激酶(JNK)通路、細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)通路、ERK5通路、P38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路。JNK和P38MAPK途徑是MAPK途徑的重要組成部分。JNK和P38MAPK可被多種因素激活(如白介素-1、腫瘤壞死因子-α、應激等)，從而特異性地激活其信號通路途徑，在炎癥反應中發揮重要作用[6]。近年來的研究表明，JNK和P38MAPK途徑在類風濕關節炎滑膜中的活化明顯加強[7]，導致關節局部炎癥及骨質破壞，是類風濕關節炎發病的重要機制之一。

全國名老中醫陳湘君教授根據多年的臨床經驗，認為類風濕關節炎是一種以正虛為本，邪實為標，全身屬虛，局部屬實的疾病。根據上述理論，我們從正虛人手，提出RA的主要治療原則是益氣健脾、補益肝腎、活血通絡。據此治療原則，本研究篩選中藥對AA大鼠進行干預治療。本課題組前期以益氣補腎活血方干預治療AA大鼠，顯示其有顯著治療效果。該復方可顯著降低AA大鼠體內TNF-α和IL-1的水平[8]。可提高OPG(骨保護素)的水平，抑制RANKL(與骨破壞密切相關的細胞因子)的水平[9]。能上調白介素-10(IL-10)，下調白介素-17( IL-17)，達到了增強抗炎，抑制促炎效應的作用，具有雙向免疫調節作用[10]。

實驗結果表明，AA大鼠滑膜JNK和P38MAPK的磷酸化表達高于正常對照組。各中藥治療組大鼠滑膜JNK的磷酸化表達水平均低于模型組，提示益氣補腎活血方可明顯降低JNK的磷酸化表達。中劑量中藥組的JNK磷酸化表達水平低于另外兩治療組，提示中劑量是抑制JNK磷酸化表達的最適劑量。各中藥治療組大鼠滑膜P38MAPK的磷酸化表達水平均低于模型對照組，提示益氣補腎活血方可明顯降低P38MAPK的磷酸化表達。中劑量中藥組的P38MAPK磷酸化表達水平低于另外兩治療組，提示中劑量是抑制P38MAPK磷酸化表達的最適劑量。上述實驗結果提示益氣補腎活血方對大鼠滑膜JNK和P38MAPK的磷酸化表達水平均有抑制作用，其中，中劑量中藥組對大鼠滑膜JNK和P38MAPK的磷酸化表達抑制作用最強。該復方治療RA的機制可能為：通過抑制滑膜JNK和P38MAPK的表達，降低其水平，減少其激活，從而抑制JNK和P38MAPK轉導途徑的活化，減少炎癥因子的釋放，抑制滑膜異常增殖和骨質侵蝕。本研究為中醫藥治療RA提供了一個新的研究方向：通過干預關節滑膜細胞轉導通路，達到治療RA的目的。

[1] Huang XY,Zhang XM,Chen FH,et al.Anti-proliferative effect of recombinant human endostatin on synovial broblasts in rats with adjuvant arthritis[J].European Journal of Pharmacology,2014,723:7-14.

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[9] 劉淑清,陳湘君.益氣補腎活血方對佐劑關節炎大鼠OPG和RANKL的影響[J].中華中醫藥學刊,2012,9(30):2091-2093.

[10] 劉淑清,陳湘君.益氣補腎活血方對佐劑關節炎大鼠IL-10和 IL-17的影響[J].風濕病與關節炎,2013,2(12):26-29.

Effects of Yiqi Bushen Huoxue Decoction on JNK and P38MAPK in Rats with Adjuvant Arthritis

LIU Jia-chang,SUN Yan-ni,PENG Yi-feng,LIU Shu-qing*

(PutuoHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200062,China)

Objective: To observe the effect of Yiqi Bushen Huoxue decoction on JNK and P38MAPK in rats with adjuvant arthritis (AA),in order to investigate the treatment mechanism of Yiqi Bushen Huoxue decoction on rheumatoid arthritis(RA).Methods:With the tripterygium glycosides as the control drug,the AA rats received gavage treatment of Yiqi Bushen Huoxue decoction.Observe the joint swelling degree of SD rats and detect the phosphorylated expression level of JNK and P38MAPK in the synovial tissue. Results:Yiqi Bushen Huoxue decoction could significantly reduce the joint swelling degree of AA rats. In addition,it could reduce the phosphorylated expression level of JNK and P38MAPK in the synovial tissue. Conclusion:Yiqi Bushen Huoxue decoction can significantly relieve the clinical symptom of RA.In addition,our study also indicates that Yiqi Bushen Huoxue decoction may treat RA by increasing the level of JNK and P38MAPK.

Rheumatoid arthritis; c-Jun N-terminal kinase;P38 mitogen-activated protein kinases;Rats with adjuvant arthritis;Yiqi Bushen Huoxue decoction;Tripterygium glycosides

上海中醫藥大學附屬普陀醫院院級重點課題(No.2013ZD192)

劉家昌(1988-)，男，碩士研究生，主要研究方向：中醫藥治療風濕病的臨床和實驗研究。

劉淑清*(1973-)，女，醫學博士，副主任醫師，主要研究方向：中醫藥治療風濕病的臨床和實驗研究。

2015-11-04

R285.5

A

1002-2406(2016)05-0039-03

修回日期：2015-12-01