UPLC-DAD法同時測定刺五加葉中Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin四種成分的含量

翟春梅，史連宏，陳忠新，王知斌，孟永海*

(1.黑龍江中醫藥大學，北藥基礎與應用研究省部共建教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

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質 量 工 藝

UPLC-DAD法同時測定刺五加葉中Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin四種成分的含量

翟春梅1,2，史連宏1,2，陳忠新1,2，王知斌1,2，孟永海1,2*

(1.黑龍江中醫藥大學，北藥基礎與應用研究省部共建教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：建立UPLC同時定量刺五加葉藥材中Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin等4種有效成分的方法。方法:色譜柱：HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters)；柱溫：40℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：5 μL；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈；梯度洗脫，洗脫條件：0～8 min，88%～75% A；8～9 min，75%～88% A；9～10 min，88%～88%A；紫外檢測波長：360 nm。結果：對9批產地的刺五加葉藥材進行測定，綠原酸最高的是虎林(1.287 mg/g)；蘆丁含量最高的是雞東(0.122 mg/g)；金絲桃苷含量最高的是賓縣(0.528 mg/g)；異槲皮苷含量最高的是五常(0.337 mg/g)。結論：該方法可用于刺五加葉中四種成分的含量測定，本研究所建立的方法穩定性、精密度、重復性良好，適用于刺五加葉的含量測定；不同來源的藥材成分含量差異顯著，對刺五加實施多指標的含量控制是保證其臨床藥用安全可控的必要途徑。

刺五加葉；UPLC-DAD；綠原酸；蘆丁；金絲桃苷；異檞皮苷

中藥“刺五加” (根莖)自古即被視為具有添精補髓及抗衰老作用的良藥，主要用于治療風濕痹痛，腰膝酸痛等證。現代研究其具有抗疲勞、抗癌、抗心律失常、降血糖等作用。然而，由于刺五加食用藥用價值均高，長期以來一直被掠奪式的采挖，致使野生資源遭到了嚴重破壞，1992年中國植物紅皮書已將刺五加列入漸危物種。然而如何使刺五加物盡其用，又能保護其資源呢？刺五加葉資源豐富、可再生，大部分刺五加葉自生自滅，至今無人利用。我國學者對刺五加葉進行了治療糖尿病藥理學研究[1-7]，發現其具有良好的治療糖尿病活性。葉中主要含有皂苷類、黃酮類和酚酸類等成分，與其根莖中的成分大部分類似[8]，黃酮及酚酸類成分中的蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、綠原酸等成分含量較高。本研究釆用超高效液相色譜法并結合超高效液相色譜柱，在10 min內同時測定了刺五加葉中這四種主要成分的含量，并進行了全面的方法學考察。本研究建立了一種快速、有效地控制刺五加葉的質量的方法。

1 實驗儀器和材料

ACQUITYTMUPLC超高效液相色譜系統，Xevo QTof MS質譜系統(美國Waters公司)，采用電噴霧離子源(ESI)、二元高壓泵、在線脫氣裝置、自動進樣器、柱溫箱。數據采集與處理采用Masslynx 4.1軟件。數控超聲波清洗器(型號：KQ-500DB，昆山市超聲儀器有限公司)；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；Milli‐Q 純水器(密理博上海貿易有限公司)。

乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；甲酸(色譜純，美國TEDIA公司)；對照品金絲桃苷(批號111521-200303，含量≥98%,HPLC) 購于中國藥品生物制品檢定中心。對照品綠原酸(批號110753)，蘆丁(批號MUST-14102301)， 異槲皮苷(批號MUST-14070211)均購于成都曼斯特生物科技有限公司。

刺五加葉藥材購自黑龍江省綏芬河地區，經黑龍江中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室王振月教授鑒定為五加科植物刺五加(Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harm)的干燥葉。

圖1 綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的化學結構式

2 方法與結果

2.1 標準品與供試品溶液的制備

精密稱取對照品(經減壓干燥至恒重)綠原酸5.06 mg，蘆丁4.12 mg，金絲桃苷6.19 mg，異槲皮苷5.08 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇分別配置成濃度為506 μg/mL，412 μg/mL,619 μg/mL,508 μg/mL的單一對照品儲備液。再將儲備液制成6個濃度的混合標準品溶液，構建成標準曲線。將刺五加葉藥材干燥并粉碎，過0.9 mm篩后用石油醚浸泡后超聲30 min，棄去浸提液，再加石油醚超聲，反復多次至浸提無色，使葉綠素完全除去后傾去浸提液，將藥材殘渣置于通風處干燥。精密稱取2 g藥材粉末置具塞錐形瓶中并向其中加入50 mL甲醇，密塞并稱定其重量，浸泡2 h后，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)60 min，放冷后，稱定其重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻并濾過，濾液為供試品溶液。

2.2 色譜條件及系統適用性

色譜柱：HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters)；柱溫：40℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：5 μL；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈；梯度洗脫，洗脫條件：0～8 min，88%～75% A；8～9 min，75%～88% A；9～10 min，88%～88%A；檢測波長：360 nm。甲醇按上述色譜法測定，結果表明溶劑對綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的測定無干擾。見圖2。

圖2 樣品(A)、對照品(B)空白對照色譜圖(C)注：1.綠原酸(Chlorogenic acid);2.蘆丁(Rutin);3.金絲桃苷(Hyperoside);4.異槲皮苷(Isoquercitrin)。

2.3 線性關系考察

精密吸取上述2.1制備的儲備液配制成不同濃度的對照品溶液，按照2.2色譜條件項下進行測定，進樣體積為5 μL。以進樣濃度為橫坐標(X)，以峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，結果線性關系良好，見表1。

表1 Chlorogenic acid,Rutin,Hyperoside及Isoquercitrin標準曲線方程

2.4 精密度試驗

日內精密度：分別精密吸取三個不同濃度的含有綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的混合對照品溶液5 μL，重復進樣3次測定峰面積，代入標準曲線計算出濃度，計算濃度的RSD值。

日間精密度：分別精密吸取三個不同濃度的對照品溶液5 μL，連續進樣3天測定峰面積，代入標準曲線計算出濃度，計算濃度的RSD值。結果綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷濃度的 RSD均小于5%，表明精密度良好。

2.5 重復性試驗

精密稱取同一批刺五加葉藥材9份，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，包括高、中、低三個不同的濃度并且每個濃度一式三份，進行測定，記錄峰面積，計算含量。結果顯示綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷濃度的RSD均小于5%，說明該方法重復性良好。

2.6 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液5 μL，分別于0、2、4、6、8、12和24 h進樣，記錄色譜峰面積，分別按樣品含量測定法測定。結果顯示綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷峰面積的RSD均小于5%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品，分別加入綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液，包括高、中、低三個不同的濃度并且每個濃度一式三份，測定并計算各成分的加樣回收率以及RSD。(測得值-樣品中含量)/加入量×100%。結果顯示綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的加樣回收率RSD均小于5%，表明該方法的準確度良好。

2.8 樣品含量測定

結果表明該方法可用于刺五加葉中四種成分的含量測定，并對9批產地的刺五加葉藥材進行測定，結果(見表2)發現9批產地中，綠原酸最高的是虎林(1.287 mg/g)；蘆丁含量最高的是雞東(0.122 mg/g)；金絲桃苷含量最高的是賓縣(0.528 mg/g)；異槲皮苷含量最高的是五常(0.337 mg/g)；綜合考慮，質量最優的產地是五常，是為進一步的藥理研究及中藥藥效物質研究提供依據。

表2 9批產地的刺五加葉中四種成分的含量測定

3 討論與小結

3.1 供試品溶液的制備方法的選擇

用超聲提取法提取，考察了提取溶劑甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇、60%乙醇，結果以50%乙醇提取率最高，故提取溶劑選擇50%乙醇。對提取時間(30 min，60 min，90 min)，提取次數(1次，2次)因素進行考察，用50%乙醇50 mL提取時間90 min，提取2次的提取率最高。

3.2 色譜條件的選擇

考察了甲醇-水，乙腈-水系統在不同的梯度下并向其中加入不同比率的甲酸，乙酸及甲酸銨。發現乙腈-水系統并分別向其中加入0.1%甲酸為最優條件。此條件下峰形較好，分析時間短，高分離度，柱壓低。選擇合適的梯度是分離的關鍵，因為本實驗中金絲桃苷和異槲皮苷是同分異構體，極性非常相似，比較難分離。曾有文獻研究通過高效液相色譜法分離這兩種化合物，但分離的時間較長，條件繁瑣。本實驗采用超高效液相色譜，簡單、快速地將其基線分離并準確測量出其含量。

3.3 小結

本章建立了一種靈敏度高、穩定性好、簡單快速的UPLC-DAD的含量檢測方法。主要是對刺五加葉中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的含量測定方法，并對該方法進行了系統的方法學考察，結果表明該方法可用于刺五加葉中四種成分的含量測定，為進一步闡明開發刺五加葉提供實驗依據。

[1] 睢大筼,呂忠智,李淑慧,等.刺五加葉皂甙降血糖作用[J].中國中藥雜志,1994,19(11):683-6851.

[2] 睢大筼,呂忠智,于曉鳳.刺五加葉皂甙的抗應激作用研究[J].人參研究,1996,8(11):34-36.

[3] 倪勁松,吳家祥,肖紉秋,等.刺五加皂甙對糖尿病大鼠血過氧化脂質和超氧化物歧化酶的影響[J].白求恩醫科大學學報,1998,24(1):33-34.

[4] 王杰,田剛,劉立刺,等.五加葉皂甙對免疫功能的影響[J].人參研究,1997,9(3):35-36.

[5] 王柏欣,王淑湘,譚宏,等.刺五加葉皂甙對糖尿病大鼠脂質過氧化物的作用[J].黑龍江醫藥科學,2004,27(2):1-2.

[6] 扈清云,李艷君,王景濤,等.刺五加葉皂甙對II型糖尿病大鼠胰島素分泌影響的形態學研究[J].黑龍江醫藥科學,2003,26(6):21-22.

[7] 趙曉蓮,關政.刺五加葉皂甙對糖尿病大鼠視網膜超微結構的影響[J].黑龍江醫藥科學,2003,26(6):59.

[8] Huang LZ,Zhao HF,Huang BK,et al.Acanthopanax senticosus: review of botany, chemistry and pharmacology[J].Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences,2011,66(2):83-97.

UPLC-DAD Method for Quantification on Chlorogenic Acid, Rutin,Hyperoside and Isoquercitrin in Extract of E.Senticosus Leaf

ZHAI Chun-mei1,2,SHI Lian-hong1,2,CHEN Zhong-xin1,2,WANG Zhi-bin1,2,MENG Yong-hai1,2*

(1.KeyLaboratoryofChineseMateriaMedica(MinistryofEducation)HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineandNaturalMedicinePharmacodynamicMaterialBasesResearchinHeilongjiangProvince,Harbin150040,China)

Objective:To establish the UPLC-DAD method for quantification on Chlorogenic acid, Rutin, Hyperoside and Isoquercitrin in extract of E. senticosus leaf. Methods:Column: HSS T3 (100 mm×2.1 mm,1.8 μm, Waters); Column temperature: 40℃; Flow rate: 0.4 mL/min; Injection volume: 5 μL; Mobile phase A: 0.1% aqueous formic acid, Mobile phase B: acetonitrile; Gradient elution conditions: 0-8 min: 88%-75%A,8-9 min: 75%-88%A,9-10 min: 88%-88%A. Detection wavelength: 360 nm. Results：Totally 55 compounds including triterpenoid saponins, flavonoid glycosides, organic acids and other compounds were identified by Scifinder database and reference literatures in the optimized LC-MS conditions. Conclusion：It is a fast, accurate and comprehensive method to identify the chemical ingredients of E. senticosus leaf by UPLC/Q-TOF-MS/MS.

E.senticosus leaf; UPLC-DAD;Chlorogenic acid;Rutin;Hyperoside;Isoquercitrin

黑龍江省青年科學基金項目(No.QC2012C064)；黑龍江中醫藥大學優秀青年教師支持計劃項目(No.2012RCQ16)

翟春梅(1978-)，女，中藥學博士，高級實驗師，主要研究方向：中藥藥效物質基礎研究。

孟永海*(1978-)，男，副教授，碩士研究生導師，主要研究方向：中藥藥效物質基礎研究。

2016-04-11

R28

A

1002-2406(2016)05-0052-03

修回日期：2016-05-04