合并支原體感染的大葉性肺炎患兒肺泡灌洗液中常規細胞學檢測及意義*

王云霞，劉文光，谷強

（1.石河子大學醫學院，新疆石河子832000；2.石河子大學醫學院第一附屬醫院兒科，新疆石河子832000）

論著

合并支原體感染的大葉性肺炎患兒肺泡灌洗液中常規細胞學檢測及意義*

王云霞1，劉文光2，谷強2

（1.石河子大學醫學院，新疆石河子832000；2.石河子大學醫學院第一附屬醫院兒科，新疆石河子832000）

目的研究大葉性肺炎患兒支氣管肺泡灌洗液（BALF）中常規細胞學形態學檢測、肺炎支原體-DNA（MP-DNA）及細胞因子白細胞介素-17（IL-17）水平，探討其臨床意義及相互關系。方法選取確診為大葉性肺炎并行支氣管肺泡灌洗術（BAL）的患兒87例，行BAL當天對患兒行臨床肺部感染評分（CPIS）分為：重癥組27例，輕癥組60例；根據BALF免疫熒光定量MP-DNA結果，分為支原體感染73例：中拷貝組32例、高拷貝組41例，無支原體感染14例；ELISA法檢測BALF中IL-17水平，對BALF中細胞HE染色后放大100倍計數，比較各組間常規細胞學計數百分比差異。結果BALF中中性粒細胞百分比（NE%）、淋巴細胞百分比（LY%）與血清中NE%和LY%無相關性（P＞0.05）；輕癥組患兒BALF中柱狀上皮細胞計數百分比高于重癥組，并且重癥組患兒BALF中巨噬細胞百分比高于輕癥組（P＜0.05）；高拷貝組NE%高于中拷貝組（P＜0.05），且NE%與BALF中IL-17水平及MP-DNA拷貝均呈正相關（r1=0.49，P=0.000，r2=0.48，P=0.000）。結論大葉性肺炎肺泡灌洗液中成分更能反應大葉性肺炎局部炎癥情況；大葉性肺炎發生時柱狀上皮細胞受損脫落，同時巨噬細胞趨化聚集參與炎癥反應；肺炎支原體感染時，IL-17通過中性粒細胞募集作用發揮抗感染能力，BALF中NE%可間接反映患兒局部感染支原體拷貝數。

大葉性肺炎；支原體感染；支氣管肺泡灌洗液；常規細胞染色；白細胞介素-17；兒童

大葉性肺炎是常見的社區獲得性肺炎之一，具有起病急、病情重和病程長等特點［1］。近年來大葉性肺炎患兒肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）感染率逐年上升，不但呼吸系統受累，還引起多系統損害，并且重癥病例逐漸增多，嚴重時甚至引起死亡，引起廣泛關注［2］。支氣管肺泡灌洗術（bronchoalveolar lavage，BAL）是大葉性肺炎診治的一種重要技術，可獲得肺泡上皮表層液體中細胞成分和可溶性成分，其對于肺部疾病的機制研究及其診治有重要的意義。研究大葉性肺炎患兒支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中常規細胞學形態學檢測、肺炎支原體-DNA（mycoplasma pneumoniae deoxyribonucleic acid，MP-DNA）滴度及細胞因子白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）水平，可深入探討大葉性肺炎免疫學機制，有利于疾病的診治。

1　資料與方法

1.1一般資料

參照《諸福棠實用兒科學》兒童大葉性肺炎診斷標準［3］，選取石河子大學第一附屬醫院兒科2014年3月-2015年7月以大葉性肺炎收住并行BAL的患兒，共87例。其中，男48例，女39例，年齡3～14歲，平均（8.20±3.88）歲。操作過程中留取灌洗液。所有患兒入院均行血常規、胸片和肺部CT等檢查，所獲取BALF均進行細菌培養、免疫熒光MP-DNA及HE染色細胞學等檢查。所選患兒行BAL前均未使用糖皮質激素或丙球蛋白等免疫調節藥物。行BAL當天對患兒行臨床肺部感染評分（clinical pulmonary infection score，CPIS），CPIS≥6分（27例）為重癥組：年齡（8.22±4.35）歲，男17例，女10例；CPIS＜6分（60例）為輕癥組：年齡（8.27±3.67）歲，男31例，女29例。CPIS是綜合臨床、影像和微生物學標準的評分系統，可用來評價大葉性肺炎的嚴重程度，大葉性肺炎評分≥6分為重度大葉性肺炎［4］。根據BALF免疫熒光定量MP-DNA結果，分為支原體感染組73例，其中：中拷貝組（MP-DNA：103～106）：32例，年齡（8.20±3.46）歲；高拷貝組（MP-DNA：106～）41例，年齡（8.38±3.03）歲；無支原體感染14例，年齡（8.39±3.54）歲。采用ELISA法對其中的1～79例患兒檢測BALF IL-17水平，對BALF中細胞HE染色后放大100倍計數，比較各組間常規細胞學計數百分比（中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和柱狀上皮細胞等）差異。各組間性別、年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2方法

1.2.1BALF采集所有患兒術前6 h禁食水，行BAL術前均由家長簽訂有創操作知情同意書，靜脈鎮靜加2%利多卡因咽喉部局部麻醉，采用纖維支氣管鏡經鼻、咽喉、聲門進入氣道，檢查各段支氣管無新生物和其他病變后，結合術前胸片及肺CT的定位結果，尋找病變部位的支氣管開口，37℃生理鹽水灌洗受累的肺段，1.0ml/kg至少灌洗3次，總量不超過1.0～2.0ml/kg，隨即負壓吸引，至少30%灌輸液被回收，留取肺泡灌洗液標本，緩慢拔出纖維支氣管鏡。獲取新鮮BALF標本立即送往實驗室行細胞學、MP-DNA和細菌培養等檢查，留取標本3ml儲存在-80℃冰箱，等待測定IL-17水平。

1.2.2實驗測定MP-DNA：PCR試劑盒（PCR熒光探針法）由中山大學達安基因股份有限公司提供，PCR儀為美國ABIPrism7300基因擴增儀；BALF細胞檢查：通過離心作用將一定數量的BALF細胞平鋪于載玻片上，冷風吹干，無水乙醇中固定30min后進行HE染色，100倍光學顯微鏡下細胞分類計數；IL-17測定：雙抗體夾心ELISA法測定，試劑盒由武漢優爾生商貿有限公司提供。以上操作步驟均嚴格按照說明書進行。

1.3統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析，正態分布計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間均數比較采用t檢驗；非正態分布計量資料以中位數（四分位間距）表示，組間比較采用秩和檢驗；雙變量符合正態性檢驗用Pearson相關分析，不符合則用Spearman相關，P＜0.05差異有統計學意義。

2　結果

2.1患兒BALF中相關指標的相關性

BALF中中性粒細胞百分比（neutrophilicgranulocyte%，NE%）、淋巴細胞百分比（lymphocyte%，LY%）與血清中NE%、LY%未發現相關性（P＞0.05）。見表1。

2.2重癥組患兒與輕癥組患兒相關指標比較

重癥組患兒BALF中柱狀上皮細胞百分比低于輕癥組，并且重癥組BALF巨噬細胞百分比高于輕癥組差異有統計學意義（P＜0.05）；NE%、LY%和組織細胞百分比在兩組間差異無統計學意義。見表2。

2.3高拷貝組與中拷貝組相關指標比較

高拷貝組NE%高于中拷貝組，差異有統計學意義（P＜0.05），LY%、巨噬細胞百分比、柱狀上皮細胞百分比和組織細胞百分比在各組間差異無統計學意義。見表3。

2.4BALF中各指標的相關性

BALF中NE%與BALF中IL-17水平及MP-DNA拷貝均呈正相關（r1=0.49，P=0.000，r2=0.48，P= 0.000）。見表4。

表1　患兒BALF中NE%、LY%與血清中NE%、LY%相關性分析

表2　重癥、輕癥大葉性肺炎患兒肺泡灌洗液常規細胞計數比較%

表3　高拷貝組、中拷貝組患兒肺泡灌洗液常規細胞計數比較%

表4　BALF中NE%與IL-17、MP-DNA拷貝相關性分析

3　討論

大葉性肺炎是兒童時期比較嚴重的下呼吸道感染性疾病，病原體感染時，肺局部抗感染能力較強，易出現較大炎癥病灶，局限在一葉或多葉。本研究發現BALF中NE%、LY%與血清中NE%、LY%無相關性（P＞0.05），表明大葉性肺炎發生時，肺部局部炎癥與全身炎癥反應程度不平行，BALF中成分更能反應大葉性肺炎局部炎癥情況。

正常人BALF細胞總數報道差別較大，約在9～26×106/ml，其中單核/巨噬細胞＞85%、淋巴細胞＜12%、中性粒細胞＜2%、嗜酸性粒細胞＜1%［5］。細胞總數和各組分比例改變可提示多種肺部疾病。假復層纖毛柱狀上皮主要存在于呼吸道，其中柱狀細胞最多，主要分布于氣管、支氣管、肺泡的腔面，具有保護和分泌功能，急慢性炎癥可引起上皮細胞脫落并發生形態改變［6］。病原微生物感染可導致氣道上皮的完整性破壞或纖毛柱狀上皮細胞的鱗狀化生或持續氣道炎癥，氣道上皮被破壞越嚴重則病情越重。病菌侵入肺部呼吸道的第一道防線肺泡巨噬細胞大量趨化浸潤，提呈抗原，吞噬脫落細胞，同時分泌促炎和抗炎細胞因子，在炎癥反應過程中既是啟動細胞，也是炎癥因子作用的靶細胞［7］，對于控制病情有重要作用。BALF中巨噬細胞計數百分比升高可能提示大葉性肺炎病情較重。本文未對細胞形態學作進一步描述，BALF中細胞形態學值得進一步研究。

肺炎支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生存的最小微生物，無細胞壁。近年來，呈大葉性肺炎改變的支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）有逐漸增多的趨勢。高拷貝組BALF中NE%高于中拷貝組，差異有統計學意義（P＜0.05），并且NE%與MP-DNA拷貝呈正相關。肺炎支原體感染宿主后，巨噬細胞和樹突狀細胞攝取并處理抗原引起炎癥反應。肺炎支原體可對上皮細胞造成持續損傷，使病原體易于在上皮細胞內定植并出現大量繁殖，BALF細胞學檢查中性粒細胞比例升高［8］。本研究還發現BALF的NE%與BALF中IL-17正相關。在肺炎支原體感染時，IL-17能夠刺激人支氣管上皮細胞、肺纖維原細胞產生中性粒細胞，介導炎癥反應。支原體侵犯肺部細胞時，IL-17通過強大的嗜中性粒細胞募集作用來清除病原體［9］，同時也刺激多種細胞產生大量前炎癥因子，與之協同作用，放大炎癥效應［10］。

綜上所述，大葉性肺炎患兒BALF中常規細胞學檢測對病情判斷及支原體感染有重要意義：大葉性肺炎發生時柱狀上皮細胞受損脫落，巨噬細胞趨化聚集參與炎癥反應；肺炎支原體感染時，IL-17通過中性粒細胞募集作用發揮抗感染能力，BALF的NE%越高則局部支原體感染拷貝數越高。

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（曾文軍編輯）

Cell suspension and level of IL-17 in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）of children with labor pneumonia combined with mycoplasma pneumonia and its clinical significance*

Yun-xiaWang1，Wen-guang Liu2，Qiang Gu2
（1.Medical College of Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000，China；2.Departmentof Pediatrics，the First Affiliated Hospital of Medical College of Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000，China）

Objective To explore cell suspension and level of IL-17 in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）of children with labor pneumonia combined with mycoplasma pneumonia and its clinical significance.Methods 87 children with labor pneumonia who had been done BAL were divided into CPIS≥6 group and CPIS＜6 group according to the clinical pneumonia infection score（CPIS）.Meanwhile，according to the results of MP-DNA，we grouped the children above into combined with mycoplasma pneumonia infection group and no mycoplasma pneumonia infection group，then combined with mycoplasma pneumonia infection group into group ofMP-DNA:103～106and group of MP-DNA:106～.ELISA method was used to detect IL-17 level，HE staining and microscopy to sort cells，PCR detect MP-DNA.Results The percentage of neutrophils and lymphocytes in BALF are not related to that in blood（P＞0.05）.The percentage of columnar epithelial cells in CPIS＜6 group were higher than CPIS≥6，how－ever，macrophagocyte was lower（P＜0.05）.The percentage of neutrophils are related with both MP-DNA（r=0.48，P=0.000）and IL-17（r=0.49，P=0.000）.Conclusions The composition of BALF is more appropriate to react the circumstance of lobar pneumonia.When lobar pneumonia occurs，columnar epithelial cells are damaged，macrophagocyte gathered to participate in the inflammatory response.In Mycoplasma pneumonia infection group，IL-17 raises neutrophils to resist infection，NE%in BALF can indirectly reflect the mycoplasma infection degree.

labor pneumonia；mycoplasma pneumonia infection；BALF；conventional cells staining；interleukin-17；children

R 563.11；R 725.6

A

10.3969/j.issn.1007-1989.2016.02.007

1007-1989（2016）02-0030-04

2015-11-10

兵團科技支疆計劃項目（No：2013AB027）

谷強，E-mail：guqiang106@sina.com；Tel：18999538901