針刺對人羊膜間充質細胞移植治療去卵巢大鼠骨質疏松的協(xié)同效應

陳玉敏，陳濤平，韓翠玉，史同煥，董淑香

(1.河北大學醫(yī)學院，生理教研室，保定 071000；2.河北大學附屬醫(yī)院，骨科，保定 071000)

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針刺對人羊膜間充質細胞移植治療去卵巢大鼠骨質疏松的協(xié)同效應

陳玉敏1，陳濤平2，韓翠玉2，史同煥2，董淑香2

(1.河北大學醫(yī)學院，生理教研室，保定 071000；2.河北大學附屬醫(yī)院，骨科，保定 071000)

目的 探討針刺聯(lián)合人羊膜間充質細胞(human amniotic mesenchymal cells, HAMCs)移植對去卵巢骨質疏松協(xié)同效應研究。方法 選擇雌性未孕的Wistar大鼠45只，完全隨機分組分為假手術組、模型組及實驗組(針刺+人羊膜間充質細胞移植)，每組各15只。各組手術傷口恢復后， 第 7 天開行針刺+尾靜脈注射HAMCs液(假手術組除外)連續(xù)干預12 周，于末次干預后 24 h，處死大鼠并采集標本。從開始干預至處死，每周測定1次各組大鼠的體質量，雙能 X 線吸收骨密度儀分別測定左側股骨中點、 遠端和近端骨密度，用原子吸收法測定其骨鈣含量；干預12 周后采用ELISA法檢測血清 25- 羥基維生素 D(25- HVD)、 I 型膠原 C 端肽(CTX-I)、 骨特異性堿性磷酸酶(BAP)、 抗酒石酸酸性磷酸酶 5b (TRAP5b)的表達變化；干預12 周后檢測各組大鼠生物力學性能的變化。干預12 周后RT-PCR技術檢測椎骨中轉化生長因子 β1(TGF-β1)的基因表達情況。結果 假手術組大鼠體重逐漸增加，符合動物自然生長規(guī)律，模型組于造模后兩個月開始，體重卻明顯高于假手術組，實驗組體重漸增， 與假手術組相近。模型組比較假手術組的骨密度和骨鈣含量均降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)，與模型組較，實驗組的骨密度和骨鈣含量含量均升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)。ELISA法顯示，血清 25-HVD、 CTX- I、 BAP、TRAP5b的表達，與假手術組比較，模型組顯著降低，與模型組比較，實驗組顯著升高，(P<0. 05)。生物法力學檢測顯示，假手術組的極限載荷、極限應力和彈性模量比模型組有顯著增高(P<0. 05)， 實驗組的極限載荷和彈性模量比假手術組有顯著增高(P<0. 05)。RT-PCR檢測顯示TGF-β1的m-RNA的表達， 與假手術組、模型組比較，實驗組明顯上調(P<0. 05)。結論 針刺聯(lián)合人羊膜間充質細胞(HAMCs)移植具有較好的對去卵巢骨質疏松協(xié)同效應，可改善去卵巢大鼠骨質疏松癥的作用。

人羊膜間充質細胞；針刺；移植；去卵巢；大鼠；骨質疏松

骨質疏松癥多見于中老年，病變特征為骨骼結構改變，骨脆性增加，強度減低，較易發(fā)生骨折。骨質疏松癥可由多種因素導致，發(fā)病機制較為復雜，可反復發(fā)生骨折，對患者的生活質量造成了嚴重的影響，同時也給患者的家庭及社會帶來較大經濟負擔[1-3]。隨著我國老齡化社會的到來，發(fā)病人數(shù)越來越多，防治骨質疏松癥已經成為一個迫切需要解決的問題[4-6]。近些年來隨著醫(yī)學科研的發(fā)展與醫(yī)療水平的提高，骨質疏松癥的治療手段也多樣化，較為常用的有藥物治療法、中醫(yī)中藥治療、中醫(yī)針灸治療、細胞移植治療等，其中細胞療法是目前實驗研究的熱點[7-9]。人羊膜間充質細胞(HAMCs)來源于羊膜組織，是孕婦產生的一種廢棄物，只要征得孕婦同意即可獲得，不受倫理道德的限制，來源廣泛，且具有在特定條件下分化為各種細胞的能力，這種特性的存在，使其為各種疾病的治療提供了新的思路[10-12]。居于以上優(yōu)點,AM-MSCs成為近幾年的研究又一熱點，其在包括免疫相關的疾病在內的多種疾病的治療方面取得了令人矚目的成績。本研究旨在聯(lián)合應用針刺及AM-MSCs移植干預去卵巢大鼠骨質疏松癥，觀察其作用效果。

1 材料和方法

1.1 材料及來源

骨密度測定儀器( 法國 GK 公司)、LG-DMEM(Gibico 公司)、胰蛋白酶(Amresco 公司)、體重計、雙能X射線骨密度測量儀(美國GE公司)、骨特異性堿性磷酸酶( BAP) 酶聯(lián)免疫測定試劑盒、大鼠 I 型膠原 C端肽( CTX-I) 檢測試劑盒、大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶 5b( TRAP5b) 檢測試劑盒(上海斯信生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物與分組：選擇2月齡45只Wistar大鼠，均為雌性、未孕，每只大鼠體重控制在215～255 g，購自河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，動物質量合格證號：【SCXK(冀)2010-0-056】。河北大學附屬醫(yī)院SPF 級實驗動物室常規(guī)飼養(yǎng)SY【XK(冀)2011-0008】，所有大鼠均在相同條件下進行飼養(yǎng)。采用完全隨機法。將45只大鼠平均分成3組，分別為假手術組、模型組及實驗組，各組均為15只。

1.2.2 模型的建立：將各組大鼠采用吸入乙醚法進行麻醉,麻醉后將大鼠固定，經皮膚消毒后，選擇腰椎后側正中為切口切開皮膚，分離兩旁肌肉，打開腹膜，找到雙側卵巢，模型組及實驗組兩組大鼠雙側卵巢需完全切除，而對假手術組大鼠的處理則為相同部位切開皮膚后，在卵巢周圍的周邊部位切下少量的組織，而不切除卵巢，操作完成后向腹腔中撒入青霉素粉末，然后相同的方法縫合皮膚。手術結束后7 d大鼠傷口愈合后，對實驗組大鼠行行針刺+尾靜脈注射HAMCs液進行干預。具體注射方法為每次為各只大鼠注射約2 mL的HAMCs細胞懸液，注射2×104個細胞，每周注射1次。具體針刺方法為：實驗組運用針刺腧穴治療,參照《實驗針灸學》動物穴位的定位方法選取“大杼”“腎俞”“脾俞”，均取雙側。將大鼠固定，穴位局部剪去鼠毛，進行常規(guī)消毒，采用一次性美容針，左手固定大鼠皮膚，右手持針準確刺入上述腧穴2～5 mm，每日1次,每次持續(xù)30 min，每隔10 min輕捻轉行針1次(持續(xù)10 s,以增強針感)。干預時長為12周，整個操作過程均由同實驗者完成[13]。

1.2.3 HAMCs的培養(yǎng)及鑒定：經過孕婦同意后，收集胎膜組織，將羊膜與絨毛膜進行分離，整個操作均在無菌條件下進行。將分離后得到的羊膜經過反復沖洗將血液及雜物沖洗干凈后，用剪刀將洗干凈的羊膜剪成乳糜樣大小的顆粒，首先向盛有羊膜的器皿中加入胰蛋白酶進行消化，再次進行沖洗將未消化的組織洗去，然后向其中加入膠原酶將組織進行徹底消化，將消化后的液體通過300目鋼網進行過濾，將過濾液進行收集，吸取少量過濾液置于離心管中，將離心管放入離型機中在1 500 r/min狀態(tài)下進行離心，10 min將其取出向其中加入 LG-DMEM 培養(yǎng)基，并吹打均勻使細胞呈完全懸浮狀態(tài)，用滴管吸取少量懸浮細胞液滴在6孔培養(yǎng)板上進行接種，接種完畢將培養(yǎng)箱調至特定狀態(tài)，將6孔板放在其中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)至第3天時，取出培養(yǎng)板棄去舊的培養(yǎng)基并重新加入新的培養(yǎng)基繼續(xù)進行培養(yǎng)，當細胞貼壁細胞數(shù)達 80%～90%后，先后加入胰蛋白酶、培養(yǎng)基，經過消化后再次進行離心，最后進行細胞傳代，當細胞生長至第3代時，取適量 AM-MSCs液注射至實驗組各只大鼠體內。最后采用光學顯微鏡對AM-MSC s進行觀察[14]。

1.2.4 測定各組大鼠的體質量:從造模后7 d開始，每周測定1次各只大鼠體重，直至造模后的第13周將大鼠處死時結束。具體操作過程為，將體重計置于桌面上，置“0”后將事先準備好的小桶置于體重計上，記錄小桶重量，然后分別將各組各只大鼠置于小桶中，記錄體重計讀數(shù)，將每次讀數(shù)減去小桶重量，分別對每只大鼠進行兩次體質量測定，為確保測定結果的準確性將兩次測定結果的平均值做為大鼠體質量[15]。

1.2.5 雙能X線吸收骨密度儀測定左側股骨中點、遠端和近端骨密度:在造模后的第13周后將各組大鼠處死，固定后，無菌條件下將大鼠左側股骨取出，標記出大鼠股骨中點，分別對大鼠左側股骨中點、近端及遠端分別進行骨密度測定。具體操作方法為將大鼠股骨中點、遠近端分別置于雙能 X 線吸收骨密度儀進行測定記錄測定值結果用于最后數(shù)據(jù)比較[16]。

1.2.6 原子吸收法測定其骨鈣含量:模型建立第13 周后，經過最后一次干預后24 h，以頸部脫臼法將各組大鼠處死，固定在支架上，用手術刀將大鼠股骨取出，將股骨上附著的組織剔除干凈，用原子吸收法對剔除干凈軟組織的股骨進行鈣含量的測定[17]。

1.2.7 采用ELISA法檢測血清:25- HVD、CTX- I、BAP、TRAP5b的表達變化:實驗組大鼠經過12周的干預后，將各組大鼠取仰臥位，固定后，用注射器經大鼠境外靜脈進行采血，將注射器中抽出的血液注入離心管，把離心機調至3 000 r/min狀態(tài)，打開離心機將離心管放入進行離心，15 min后用膠頭滴管將離心管中的上清液吸出，采用ELISA法對血清25- HVD、CTX- I、 BAP、 TRAP5b進行測定，所有操作均按照試劑盒的說明書進行。對各項結果進行記錄[18]。1.2.8 檢測各組大鼠生物力學性能的變化:于模型建立第13 周后，在末次干預后24 h，將各組大鼠處死，將大鼠固定在支架上，用手術刀將大鼠股骨取出，將股骨上附著的組織剔除干凈，然后進行股骨生物力學測試，所采用的實驗為三點彎曲實驗，將各組大鼠處理后的股骨放在試驗機上進行測試，所選擇的跨距為17 mm，加載速度為2.0 mm/min，然后根據(jù)結果對其載荷-變形曲線，應力-應變曲線進行描繪[19]。

圖1A:第6天時HAMCs(×200，標尺=50μm)；圖1B : 傳至第8代的HAMCs(×200，標尺=50μm)圖1 HAMCs的形態(tài)觀察Fig.1 Morphological observation of the HAMCs at 6th day (A) and atfter 8th passage (B).

1.2.9 RT-PCR檢測TGF-β1基因表達情況：抽取各組大鼠血液，將各組大鼠血液經過特定處理后從中提取出總的RNA，從中取出2 μL進行逆轉錄，結果為cDNA。將逆轉錄得到的片段作為PCR反應模板進行PCR反應，整個操作按照相關試劑盒說明進行。TGF-β1上下游引物委托TaKaRa生物公司設計合成。TGF-β1引物:上游5′-TTTCCCGATATT CGGGCAGC-3′,下游5′-GTACATGAGCAGGCTCAG CC-3′。β-actin引物:上游5′-TG-GTGGGTATGGGTC AGAAGGACTC-3′,下游5′-CATG-GCTGGGGTGTT GAAGGTCTCA-3′。PCR反應條件為:在94℃條件下變性，時長為1 min,然后在56℃條件下進行退火，退火時長為0.5 min，最后進行延伸，延伸所需條件為72℃，延伸時長為1 min，共經過30個循環(huán)。

2 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 HAMCs的形態(tài)觀察

貼壁細胞數(shù)隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸增多，細胞形態(tài)也由剛開始的長梭形而逐漸發(fā)生改變，第6天時貼壁細胞數(shù)量可達80%以上，此時細胞排列緊密，細胞體較前拉長，呈漩渦狀生長(圖1A)。傳代生長分為不同的時期，不同時期內細胞增殖速度是不同的，細胞增殖速度在第4 天左右是最快，當傳代至第8 代以后逐漸減慢，細胞形態(tài)變化較為明顯，胞體逐漸變大使整個細胞形態(tài)呈扁平狀。根據(jù)從生長曲線 (圖1B) 可以進行不同分期，1～3 d為細胞生長潛伏期，此期細胞呈貼壁生長，數(shù)量逐漸增多；第4～7天為細胞對數(shù)生長期，此期細胞增殖速度最快；第8天細胞增殖速度變緩，達到平臺期。

3.2 各組大鼠的體質量

分別在造模后第7天開始每周對大鼠體質量進行1次測定，將各組大鼠體質量最終結果進行比較結果顯示，假手術組大鼠在造模結束后第7天至第13周體重逐漸增加，這符合動物的自然生長規(guī)律，從造模后的第8周開始，比較模型組與假手術組體質量，模型組顯著高于假手術組；而實驗組大鼠體重在這段測定時間內逐漸增加，與假手術組結果相比，二者結果相接近。如圖2。

圖2 各組大鼠的體質量比較Fig.2 Comparison of body weight of the rats in each group

3.3 雙能X線吸收骨密度儀測定左側股骨中點、 遠端和近端骨密度

在造模后的第13周將各組大鼠處死后，取出股骨置于雙能X線吸收骨密度儀上，對各組大鼠不同部位骨骼進行骨密度檢測，標本選定均為離體骨，測定結果顯示，通過比較各組各部位骨密度結果可以得出以下結論，假手術組、模型組兩組相比，模型組骨密度升高，且二者差異具有顯著性，模型組及實驗組兩組進行比較，實驗組的骨密度升高，差異也具有顯著性(P<0.05)(表 1)。

3.4 原子吸收法測定其骨鈣含量

在模型建立第13 周后，用原子吸收法對各組大鼠骨鈣含量進行測定，選用的標本為各組大鼠左側股骨，并對各組測定結果進行比較，測定及比較結果顯示，將假手術組、模型組兩組大鼠的骨鈣含量進行比較，模型組骨鈣含量升高，而將模型組及實驗組兩組結果進行比較，結果顯示實驗組的骨鈣含量升高，且差異有顯著性意義，即P<0.05(表2)。

3.5 各組大鼠 25- HVD、CTX- I、BAP、TRAP5b的表達變化

采用ELISA法對大鼠血清 25- HVD、CTX- I、BAP、TRAP5b的表達進行測定，經各組大鼠結果比較得出結論如表3所示，首先將假手術組、模型組兩組的各項結果進行比較，比較結果顯示模型組的各項指標均呈現(xiàn)明顯的降低趨勢，然后將模型組及實驗組兩組進行比較，比較結果顯示實驗組各項指標較前者則升高顯著，差異具有顯著性意義(P<0.05)。

3.6 生物力學性能的變化

各組大鼠經過不同處理后，生物力學性能均發(fā)生不同變化，采用三點彎曲實驗對各組大鼠生物力學性能的變化測定并對結果進行比較，從表4中可以看出，假手術組與模型組相比N，MPa，M Pa增高顯著，差異具有顯著性；而將假手術組與實驗組兩組相比，后者的N和M Pa均顯著升高，差異具有顯著性，P<0.05。

3.7 RT-PCR檢測TGF-β1基因表達情況

以RT-PCR法對各組大鼠TGF-β1基因的表達情況進行檢測，記錄檢測結果，將各組大鼠的檢測結果進行比較，結果顯示，假手術組、模型組及實驗組三組中實驗組的TGF-β1基因表達明顯上調，差異具有顯著性意義(P<0.05)，見圖3。

表1 大鼠不同部位離體骨的骨密度(BMD)值

注：aP<0.05；bP<0.05。

Note.aP<0.05；bP<0.05.

表2 針刺聯(lián)合人羊膜間充質干細胞移植對大鼠股骨鈣含量的影響

表3 各組大鼠 25- HVD、CTX- I、BAP、TRAP5b的表達影響

注：aP<0.05；bP<0.05。 Note.：aP<0.05；bP<0.05.

Tab.4 Effect of acupuncture combined with human amniotic mesenchymal stem celltransplantation on femur biomechanics in the ovariectomized rats

組別Groups極限載荷(N)Limitload(N)極限應力(MPa)Limitstress(MPa)彈性模量(MPa)Elasticmodulus(MPa)假手術組Sham142.61±14.230.985±0.1306122.01±205.43模型組Model121.06±20.14a0.759±0.216a5174.34±597.21a實驗組Experimental153.42±13.54b1.040±0.304b6752.50±165.03b

注：aP<0.05；bP<0.05。 Note.aP<0.05；bP<0.05.

圖3 各組TGF-β1基因表達情況Fig.3 Expression of TGF-β1 gene in each group

4 討論

骨質疏松癥是臨床中較為常見的一種疾病，本實驗切除雌性大鼠的卵巢使得大鼠雌激素分泌減少，從而造成骨質疏松癥模型與女性絕經后雌激素分泌減少引起的骨質疏松癥特征相似，因此可以用這種方法造模來研究絕經后骨質疏松癥[20-21]。因骨質疏松癥致病因素多，發(fā)病機制復雜，所以很難使用一種藥物來解決骨質疏松癥的所有問題。本研究采用針刺聯(lián)合HAMCs移植干預去卵巢大鼠骨質疏松癥，探討針刺是否具有骨相對特異性調節(jié)作用，尤其是抗骨質疏松的效應。

骨組織的成骨細胞和破骨細胞都有雌激素受體，骨組織形成和溶解都受到雌激素的調節(jié)。研究表明雌激素減少是性骨質疏松癥發(fā)生的主要原因，雌激素可預防治療骨質疏松癥。人的骨形成由骨吸收與骨形成相互平衡決定，這種平衡受各種因素擾亂而被打破時，骨量就會發(fā)生異常，骨結構隨即改變，從而影響骨的正常功能。女性患者在月經完全消失后，由于雌激素分泌減少，骨形成與骨吸收的平衡受到影響后，經過復雜的機制作用，導致的最終結果是骨形成與骨吸收平衡打破使骨量形成減少，從而導致的骨骼強度變小，脆性增加，所以極易發(fā)生骨折。大量研究表明雌激素對骨質疏松癥可以通過作用于相應受體而對成骨及破骨過程直接發(fā)揮作用；還可通過旁分泌機制產生大量的作用因子，對成骨及破骨過程產生間接的作用，通過各種凋亡機發(fā)揮作用[22-24]。這些作用機制增強成骨作用，而減弱破骨作用，所以雌激素可以促進骨生成，當雌激素減少時骨生成減少即可發(fā)生骨質疏松癥。

目前隨著高齡社會的到來，骨質疏松癥患者也逐年增加，其治療方法很多，但效果不是很理想。針刺是一種中醫(yī)治療方法，研究發(fā)現(xiàn)針刺可以改變機體激素分泌，通過這種內分泌的改變來影響成骨及破骨作用，因此對骨質疏松癥患者有較好的作用[25-26]。HAMCs大量相關實驗研究將其用于各種疾病的治療中，并且已經取得了令人矚目的成績，探討HAMCs用于疾病治療安全性的研究發(fā)現(xiàn)該種細胞對小鼠的肝腎功能未造成損傷，小鼠生長良好，不存在種間排異反應，且移植后無致瘤現(xiàn)象發(fā)生，安全可行[27]。骨質疏松癥發(fā)病機制復雜，目前有大量研究采用聯(lián)合法治療骨質疏松癥，但是還尚未有將HAMCs與針刺相結合干預骨質疏松癥。

本研究將這兩種治療方法聯(lián)合起來干預大鼠骨質疏松癥，通過對各組大鼠進行不同處理后觀察大鼠骨質疏松癥改善程度，結果顯示與模型組比較，實驗組的骨密度和骨鈣含量含量均升高。ELISA法顯示，血清25-HVD、 CTX-I、 BAP、TRAP5b的表達，與模型組比較，實驗組顯著升高。生物法力學檢測顯示，假手術組的極限載荷、極限應力和彈性模量比模型組有顯著增高， 實驗組的極限載荷和彈性模量比假手術組有顯著增高。RT-PCR檢測顯示TGF-β1的m-RNA的表達， 與假手術組、模型組比較，實驗組明顯上調。一系列結果均提示針刺聯(lián)合HAMCs移植對大鼠骨質疏松癥具有協(xié)同效應，可改善去卵巢大鼠骨質疏松癥的作用。然而目前對HAMCs的相關研究仍處于探索階段，將AM-MSC s移植用于臨床各種疾病的治療仍需大量研究支持，需要不斷探索，仍有許多問題需要解決。

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Synergistic effect of acupuncture and human amniotic mesenchymal stem cell transplantation on the treatment of osteoporosis in ovariectomized rats

CHEN Yu-min1, CHEN Tao-ping2, HAN Cui-yu2, SHI Tong-huan2, DONG Shu-xiang2

(1. Department of Physiology, Hebei University School of Medicine, Baoding 071000, China；2. Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000)

Objective To investigate the effect of acupuncture combined with human amniotic mesenchymal stem cells (HAMCs) transplantation on the osteoporosis in ovariectomized rats. Methods Forty-five healthy female non-pregnant Wistar rats were randomly divided into sham operated group, model group and experimental group (acupuncture + HAMC transplantation), 15 rats in each group. At 7 days after the surgical wound healing, the rats received acupuncture every day and intravenous injection of HAMCs suspension (except the sham operated group) once a week for consecutive 12 weeks. The body weight was measured every week. 24 hours after the last intervention, the rats were killed and specimens were collected. Specimens of the mid-, proximal- and distal femur were taken to measure the bone mineral density using a dual energy X-ray absorptiometer. At 12 weeks after the intervention, changes of the expression of serum 25-hydroxy-vitamin D (25-HVD), C-terminal peptide of type I collagen (CTX-I), bone specific alkaline phosphatase (BAP) and human tartrate-resistant acid phosphatase 5b (TRACP 5b) were determined by ELISA, the biomechanical properties of the removed femur was measured, and the expression of transforming growth factor-β (TGF-β) in the vertebrae was assessed by RT-PCR assay. Results Body weight of rats in the sham operation group was increased gradually in accordance with the natural growth of animals, that of the model group was significantly higher than that of the sham operated group since two months after modeling, and the body weight of the experimental group was similar to that of the sham operated group. The bone mineral density and calcium content of the model group were significantly decreased compared with that of the sham operated group (P<0.05), and the bone mineral density and bone calcium content of the experimental group were significantly higher than that of the model group (P<0.05). The ELISA showed that the expressions of serum 25-HVD, CTX I, BAP, and TRAP5b in the model group were significantly lower than that of the sham operated group, and those of the experimental group were significantly higher than that of the model group (P<0.05). Measurement of biomechanical properties showed that the limit load, limit stress and elastic modulus of the femur of the sham operated group were significantly higher than that of the model group (P<0.05), and the limit load and elastic modulus of the experimental group were significantly higher than that of the sham operated group (P<0.05). T-PCR showed that the expression of TGF-β1 m-RNA in the experimental group was significantly up-regulated than that of the sham operated and model groups (P<0.05). Conclusions Acupuncture combined with human amniotic mesenchymal stem cell (HAMCs) transplantation has a synergistic effect on the treatment of osteoporosis, and can improve the conditions in ovariectomized rats.

Human amniotic mesenchymal stem cells, HAMCs; HAMCs transplantation; Acupuncture; ovariectomized rats; Osteoporosis

陳玉敏(1976-)，女，碩士研究生，E-mail：chenyuminwt@163.com。

陳濤平。E-mail: ctp00@163.com，電話 :18603121976。

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1671-7856(2016)10-0043-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.10.009

2016-06-12