高效液相色譜法同時測定微生物酶法產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反應體系中5種物質及其樣品處理方法對色譜峰的影響分析

魏照輝,張震宇,孫付保

(江南大學 生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室 糖化學與生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122)

?

高效液相色譜法同時測定微生物酶法產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反應體系中5種物質及其樣品處理方法對色譜峰的影響分析

魏照輝,張震宇*,孫付保*

(江南大學 生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室 糖化學與生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122)

建立了同時測定微生物酶法產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反應體系中5種物質(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺、L-丙氨酸甲酯、L-谷氨酸、L-丙氨酰-L-丙氨酸)的高效液相色譜分析方法。考察了樣品處理中存在的發酵液、磷酸、三氯乙酸對色譜峰的影響，建立了一種對色譜峰無干擾的樣品處理方法。選用鄰苯二甲醛(OPA)為衍生劑，以在線衍生的方式實現了標準品或樣品的柱前自動衍生。選用C18色譜柱進行分離，柱溫40 ℃，以12.5 mmol/L磷酸鹽緩沖液(88%,pH 7.4)與12%乙腈為流動相進行等度洗脫，流速為1 mL/min，在λex=338 nm，λem=450 nm下進行熒光檢測，外標法定量。結果顯示，該色譜條件下5種物質的測定線性范圍廣，相關系數均大于0.999 4。低、中、高3組加標水平下的回收率為93.5%～104.9%，相對標準偏差(RSD)小于7%。1日內間隔2 h進行6次進樣，5種物質保留時間的RSD均小于0.12%，峰面積RSD均小于1.2%。該方法操作簡單，分離度與靈敏度高，定量精確，重復性好。

高效液相色譜法；柱前自動化衍生；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反應體系；樣品處理方法

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Alanyl-L-glutamine，L-Ala-L-Gln)是一種由L-丙氨酸與L-谷氨酰胺兩種氨基酸縮合形成的二肽，簡稱丙谷二肽。作為一種條件必需氨基酸[1]，L-谷氨酰胺(L-Gln)在醫藥臨床領域應用廣泛，可作為糖異生和尿素合成的原料[2]、神經遞質的前體[3]，可促進損傷組織的修復[4]、免疫細胞的增殖分化[5]、骨骼肌肌肉增長[6]，同時可通過增加谷胱甘肽的合成，提高機體抗氧化能力[7]。由于L-谷氨酰胺存在溶解度低、熱不穩定等缺陷導致其不能直接應用于臨床[8]。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺成功克服了L-谷氨酰胺理化性質上的缺陷，具有較高的溶解度與穩定性，且其在體內會迅速降解出L-谷氨酰胺，因此常作為L-谷氨酰胺的替代品以注射液的形式應用于臨床[9]。

目前主要通過化學合成法生產丙谷二肽[10-11]，但該方法通常存在過程復雜、成本高、易產生副產物、試劑有害等缺點，不適合大規模工業生產。本實驗室率先在國內開展了有關微生物酶法生產丙谷二肽的研究，目前已構建出一系列具備產丙谷二肽能力的微生物菌種，并實現了丙谷二肽的生物制備。這些菌種能夠表達α-氨基酸酯酰基轉移酶，在該酶的作用下，L-丙氨酸甲酯(L-AlaOMe)的酯酰基可脫除并與L-谷氨酰胺的氨基縮合形成目標產物丙谷二肽，同時，脫除酯酰基的L-丙氨酸甲酯同樣可與其自身的氨基縮合形成副產物L-丙氨酰-L-丙氨酸(L-Ala-L-Ala)[12]。此外，L-丙氨酸甲酯與L-谷氨酰胺在反應中不可能完全消耗，L-谷氨酰胺在反應過程中會部分降解為L-谷氨酸(L-Glu)。綜上，整個反應體系中存在兩種二肽(L-Ala-L-Gln，L-Ala-L-Ala)、兩種氨基酸(L-Gln，L-Glu)和一種氨基酸衍生物(L-AlaOMe)。為了對丙谷二肽生產菌種進行性能評估，需要建立一種穩定、準確、快速的檢測方法來分析反應體系中各物質的含量。

以鄰苯二甲醛(OPA)為柱前衍生劑進行氨基酸HPLC測定的技術已很成熟[13-15]，但運用HPLC法測定氨基酸甲酯鮮有報道，更無有關L-丙氨酰-L-丙氨酸測定的報道。而關于OPA衍生化測定丙谷二肽與谷氨酰胺的報道[16]也僅實現了兩種物質的單獨測定而非同時測定，且OPA衍生物極不穩定，其選用的手動衍生具有較大的測量誤差。也有文獻報道采用異硫氰酸苯酯(PITC)為柱前衍生化試劑，用紫外檢測器進行丙谷二肽的單獨檢測[17]。此外，在流動相中添加如辛烷磺酸鈉等離子對試劑，可無需衍生直接測定丙谷二肽[12]，但離子對試劑會損傷色譜柱并帶來方法的不穩定性。本研究選取鄰苯二甲醛作為衍生劑進行柱前自動衍生，建立了可同時測定寡肽、氨基酸與氨基酸衍生物3類物質的高效液相色譜檢測方法。微生物酶法生產丙谷二肽具有成本低、污染少、工藝簡單等優勢，有望取代化學合成法成為丙谷二肽的主流生產方法。該分析測定方法為丙谷二肽微生物酶法生產工藝的建立提供了必要的技術支持，具有重要的工業應用價值。此外，該方法同樣適用于臨床、飼料以及化學合成領域中丙谷二肽、L-谷氨酰胺等主體物質的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 Infinity與Waters 2695，其中Agilent 1260 Infinity配備Agilent熒光檢測器，Waters 2695配備Waters 2475熒光檢測器。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(TCI公司)；鄰苯二甲醛、巰基乙醇、L-丙氨酰-L-丙氨酸(Sigma公司)；L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(安耐吉公司)；L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、乙腈、甲醇等(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm);流速:1.0 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣量:20 μL;熒光檢測波長:λex=338 nm,λem=450 nm;流動相:乙腈(A),12.5 mmol/L磷酸鉀緩沖液(B,分別配制濃度同為12.5 mmol/L的磷酸氫二鉀與磷酸二氫鉀溶液，二者互調至pH 7.4);洗脫方式:磷酸鹽緩沖液-乙腈(88∶12)等度洗脫。

1.3 衍生劑配制

取50 mg鄰苯二甲醛和100 μLβ-巰基乙醇，加入300 μL甲醇溶解，1.6 mL 硼酸緩沖液(pH 10.0)混勻即得。硼酸緩沖液(pH 10.0)：分別配制0.05 mol/L硼砂溶液與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液，準確移取50 mL硼砂溶液與23 mL氫氧化鈉溶液于200 mL容量瓶中，混合均勻，并用水稀釋至刻度線即得。

1.4 柱前自動化在線衍生程序

吸取2 μL樣品和2 μL衍生劑混合3次，吸取16 μL硼酸緩沖液混合15次，吸取20 μL流動相混合5次，進樣。該程序可表示為：2 μL樣品+2 μL衍生劑+16 μL硼酸緩沖液+20 μL流動相。每次吸取完畢后，需運行洗針程序。

1.5 標準溶液的配制

精確稱取21.7 mgL-Ala-L-Gln，14.6 mgL-Gln，14.7 mgL-Glu，14.0 mgL-AlaOMe，16.0 mgL-Ala-L-Ala，用適量去離子水溶解后分別定容至25 mL容量瓶中，得濃度均為4 mmol/L的5種標樣母液。后續實驗所需標準品以該母液稀釋或搭配稀釋獲得。

1.6 樣品的制備與處理

1.6.1 含磷酸、三氯乙酸與發酵液的樣品處理方法 取500 μL菌液，加入500 μL底物溶液(100 mmol/LL-Gln，100 mmol/LL-AlaOMe·HCl，pH 9.0)，混勻后置于25 ℃反應1.5 h，加入等體積的磷酸溶液(1.7%)終止反應，離心(12 000 g，10 min)后吸取上清液，用等體積三氯乙酸(10%)對上清液預處理沉降蛋白，再次離心(12 000 g，10 min)后吸取上清液將其稀釋至線性范圍內，上柱分析。

1.6.2 不含磷酸、三氯乙酸與發酵液的樣品處理方法 取2 mL菌液，離心(8 000 g，5 min)后去上清發酵液，用生理鹽水清洗細胞兩次以完全清除殘留在細胞壁上的發酵液，再次離心(8 000 g，5 min)去上清生理鹽水，保留菌體，加入500 μL底物溶液(100 mmol/LL-Gln，100 mmol/LL-AlaOMe·HCl，pH 8.0)，混勻后置于25 ℃反應1.5 h，高速離心(12 000 g，10 min)反應體系并迅速吸取上清反應液以終止酶催化反應，將上清反應液稀釋至線性范圍內，上柱分析。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 檢測波長的選擇 OPA衍生化法測定氨基酸一般選取激發波長(λex)為300 ～360 nm，發射波長(λem)為450 nm左右。由于本研究涉及多種類待測物，因此選取L-Ala-L-Gln(寡肽)、L-Gln(氨基酸)、L-AlaOMe(氨基酸衍生物)3種主要且具有代表性的待測物進行波長優化實驗。對3種標準品進行柱前手動衍生化處理，選用Waters 2475多通道熒光檢測器檢測。固定發射波長為450 nm，激發波長控制在300～360 nm之間；固定激發波長為330 nm，發射波長控制在400～480 nm之間，各物質峰面積隨波長的變化曲線顯示，激發波長選取338 nm，發射波長選取450 nm時各物質均可獲得最大吸收值，因此選其作為檢測波長。

圖1 5種標樣衍生化產物的色譜圖Fig.1 Chromatogram of derivatives of five standard substances 1.L-Glu,2.L-Gln,3.L-AlaOMe,4.L-Ala-L-Gln,5.L-Ala-L-Ala

2.1.2 流動相的選擇 選取磷酸鹽緩沖液(12.5 mmol/L，pH 7.4)為流動相中的無機相，乙腈為流動相中的有機相。考察了無機相與有機相配比在70∶30～95∶5之間時各物質峰之間的分離度。結果發現，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺與L-丙氨酸甲酯之間的分離度受流動相配比的影響較大。當磷酸鹽緩沖液用量少于總體積的83%時，二者不能完全分離；當磷酸鹽緩沖液用量大于總體積的86%時，二者之間的分離度達1.5，可用于定量檢測；當磷酸鹽緩沖液用量大于總體積的95%時，流動相幾乎喪失洗脫能力，各物質峰拖尾現象嚴重。實驗最終選取兩相配比為88∶12。5種標樣衍生化產物在該流動相配比下的色譜圖見圖1。由結果可知，在該流動相下，5種物質均實現了基線分離，且峰形較好，表明該流動相適合5種物質的分離與定量分析。

2.1.3 柱溫的選擇 分別考察了30，35，40，45 ℃柱溫條件下5種物質的色譜行為。結果顯示，5種物質主峰的保留時間隨柱溫的升高而縮短，分離度均可滿足要求。考慮到色譜柱壽命與柱效等因素，并盡可能縮短樣品運行時間，柱溫選取40 ℃。

2.1.4 衍生劑用量的選擇 OPA衍生試劑毒性較大，不宜過量使用，但OPA衍生化產物極不穩定，用量過少則會造成衍生化不完全。考察了衍生劑與5種物質在不同摩爾比下的峰面積，結果顯示當OPA與待測物的摩爾比為50∶1時，各物質峰面積均達到相對極大值；高于此比例后，峰面積無明顯增加。因此，實驗選擇OPA與待測物的摩爾比為50∶1。

2.2 線性范圍與定量下限

量取一定體積5種標準品的4 mmol/L母液，用去離子水將其各自稀釋成0.08，0.16，0.20，0.24，0.32 mmol/L 的標準梯度溶液。將5種物質的標準梯度溶液經柱前在線衍生后自動稀釋20倍，即得各自最終梯度濃度(4，8，10，12，16 μmol/L)，而后上柱定量檢測，在優化條件下考察色譜圖，記錄峰面積，以10倍信噪比確定定量下限(LOQ)。5種物質的線性關系與LOQ見表1。結果顯示，5種物質具有較廣的線性范圍，且線性良好，相關系數均大于0.999 4，LOQ為0.02～0.24 μmol/L，表明該方法適合5種物質的精確定量分析。

表1 5種物質的線性關系與定量下限

*y:peak area;x:analyte concentration(μmol·L-1)

2.3 加標回收率實驗

將一真實樣品作為加標底樣，選取低(50%左右)、中(100%左右)、高(200%左右) 3組水平進行加標實驗，每個水平重復3次。加標樣同樣經柱前自動化衍生后上柱定量檢測，考察色譜圖，記錄峰面積。測定結果顯示，5種物質的平均回收率為93.5%～104.9%，相對標準偏差(RSD)在7%以內，表明該方法準確度及精密度良好，結果見表2。

表2 5種物質的加標實驗結果(n=3)

2.4 分析系統重復性實驗

取混合標準樣品1份，1日內間隔2 h進行6次進樣，觀測5種物質峰的保留時間，記錄峰面積。測得L-Ala-L-Gln，L-Gln，L-AlaOMe，L-Glu和L-Ala-L-Ala 6次進樣的出峰時間RSD值分別為0.05%，0.05%，0.07%，0.12%和0.04%，峰面積RSD值分別為0.61%，0.30%，1.2%，0.43%和0.60%。結果表明該方法穩定性較好，日內誤差小。

2.5 樣品處理方法對色譜峰的影響分析

研究初期選取“1.6.1”所述以菌液作為粗酶源的樣品處理方法，發現測量值遠小于預期值且雜峰較多。經分析,該樣品處理方法溶劑組成為發酵液(12.5%)、水(12.5%)、磷酸(25%)與三氯乙酸(50%)。考察了如表3所示7種溶劑組成下3種物質的色譜圖。分別以1號、2號溶劑配制3種主要檢測物(L-Ala-L-Gln，L-AlaOMe，L-Gln)標樣，兩種溶劑下對應的3種物質色譜圖顯示，樣品處理過程所用的發酵液、磷酸與三氯乙酸會打壓目標峰并造成峰形混亂。分別以1號、3號、4號溶劑配制L-Ala-L-Gln標樣，L-Ala-L-Gln標樣色譜圖說明，樣品處理過程中用到的發酵液會引起峰形混亂，磷酸與三氯乙酸會打壓目標峰。分別以1號、5號、6號、7號溶劑配制L-Ala-L-Gln標樣，色譜圖結果表明磷酸與三氯乙酸單獨存在或混合存在時均會對目標峰形成打壓。將另外4種標樣進行相同實驗，其結果與L-Ala-L-Gln類似。

表3 7種溶劑組成

發酵液中存在其他具有游離氨基的組分，因此會引起峰形混亂。推測磷酸與三氯乙酸引起目標峰打壓的原因如下：①OPA衍生化反應要求體系的pH值呈堿性，兩種酸的存在會大幅度降低體系的pH值從而導致衍生化反應不能正常進行；②氨基酸、氨基酸衍生物以及寡肽是兩性物質，其α-氨基可與酸結合生成共價化合物，而OPA的衍生機理顯示，被檢測物的α-氨基必須以游離形式存在，方能衍生。而磷酸與三氯乙酸的存在會大幅度降低反應體系中游離氨基的數量，導致待測物不能被正常衍生。磷酸還可促使生物酶失活使之催化效力喪失，其常用作酶催化反應的終止劑。發酵液中存在一定的大分子蛋白，易造成色譜柱堵塞，因此含有發酵液的樣品通常不可直接上柱做HPLC分析。作為一種常用的蛋白變性劑，三氯乙酸可促使蛋白質的構象發生改變，暴露出較多的疏水性基團，使之聚集沉降，其常用于發酵液中大分子蛋白的柱前沉降預處理。上述兩種酸雖然在微生物發酵液檢測領域有著廣泛的應用，但通過本部分結果可知這兩種酸不可用于OPA衍生化HPLC法檢測發酵液中富含氨基的物質，因此本研究發現具有一定的現實指導意義。

2.6 樣品處理方法的建立及實際樣品測定

圖2 實際樣品與標準品的對照色譜圖Fig.2 Chromatograms of actual sample and standard sample1.L-Glu，2.L-Gln，3.L-AlaOMe，4.L-Ala-L-Gln，5.L-Ala-L-Ala

由于α-氨基酸酯酰基轉移酶屬于微生物胞內酶，所以既可選用微生物菌液也可選用菌體自身作為粗酶源來參與催化反應。根據“2.5”結論建立了“1.6.2”所述樣品處理方法。該樣品處理方法與“1.6.1”相比有以下優勢：以菌體代替菌液作為粗酶源參與酶催化反應，可消除發酵液造成的峰形混亂與三氯乙酸造成的峰形干擾；以高速離心的方式代替磷酸終止酶催化反應，可解除磷酸對峰形的干擾；加大酶量的同時濃縮了待測體積，便于樣品制備時多種稀釋倍數的選擇。在該處理方法下，將樣品稀釋至“2.2”所述線性范圍內，經柱前在線衍生后，按照“2.1”色譜條件定量檢測。兩種底物濃度均為100 mmol·L-1時，各丙谷二肽生產菌種的測定結果如表4所示。結果顯示，pAMP質粒是SAET的最適表達載體，而E.coliJM109是這一表達載體的最適宿主。最優菌種E.coliJM109/pAMP-SAET的丙谷二肽產量可達到45.67 mmol·L-1。實際樣品與標準品的對照色譜圖見圖2。

表4 L-Ala-L-Gln生產菌種的測定結果

3 結 論

本文建立了一種可同時測定微生物酶法產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反應體系中5種物質的高效液相色譜分析方法，并著重分析了樣品處理方法對色譜峰的影響。結果表明，該方法具有操作簡便、回收率與靈敏度高、重復性好等優點，為丙谷二肽生產菌種的性能評估與工業化放大生產提供了有力的技術支持。另外，研究發現使用柱前衍生化HPLC法測定氨基酸、氨基酸衍生物以及寡肽等具有游離氨基的物質時，磷酸與三氯乙酸會嚴重影響色譜峰，應盡量避免使用。

[1] Makoto Y,Shin-Ichi H.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2008,81(1):13-22.

[2] Malcolm W,Brosnan John T.Chin.J.Clin.Nutrit.,2014,22(1):1-8.

[3] Shu X L,Wang J,Geng S S,Cai D L.Parenteral&EnteralNutrition(舒曉亮,王晶,耿珊珊,蔡東聯.腸外與腸內營養),2005,12(6):329-331.

[4] Wang S S,Liang K.MedicalRecapitulate(王歲歲,梁琨.醫學綜述),2010,16(4):521-523.

[5] Lai Y,Yeh S,Lin M,Shang H,Yeh C,Chen W.Nutrition,2004,20(3):286-291.

[6] Wernerman J,Luo J L,Hammarqvist F.Proceed.Nutrit.Soc.,1999,58(3):677-680.

[7] Wu J,Cai W.Parenteral&EnteralNutrition(吳江,蔡威.腸外與腸內營養),2004,11(2):108-111.

[8] Zhang W R,Yang G Q,Wang H S.ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine(張維睿,楊桂芹,王宏山.中國畜牧獸醫),2004,31(7):10-12.

[9] Tabata K,Hashimoto S.Appl.Environm.Microbiol.,2007,73(20):6378-6385.

[10] Tang G,Zhao Y F,Xu P X.Xiamen University.China Patent(唐果，趙玉芬，許鵬翔.廈門大學.中國專利),CN200510054083.3.[2005-10-19].

[11] Tang G.SynthesisandMechanismStudiesonL-Alanyl-L-Glutamine.Xiamen:Xiamen University(唐果.N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的合成與反應研究.廈門:廈門大學),2004.

[12] Yoshinori H,Yasuhiro M,Ikuo K,Isao A,Kenzo Y.Biosci.Biotechnol.Biochem.,2013,77(3):618-623.

[13] Mu D H.Chin.J.Chromatogr.(牟德海.色譜),1997,15(4):319-321.

[14] Yang W,Xian S,Li D X,Wan X C.J.TeaSci.(楊衛,鮮殊,李大祥,宛曉春.茶葉科學),2011,31(3):211-217.

[15] Zhu Z J.Chin.J.Anal.Chem.(朱智甲.分析化學),2000,28(5):609-612.

[16] Zhou R Y.FeedRes.(周榮艷.飼料研究),2004,(1):30-32.

[17] Zhang Y C,Wang D D.Chin.J.Biochem.Pharm.(張云楚,王丹丹.中國生化藥物雜志),2006,27(6):364-366.

Simultaneous Determination of 5 Substances in the Microbial Enzymatic Reaction System of L-Alanyl-L-glutamine by High Performance Liquid Chromatography and the Influence of Sample Preparation on Chromatographic Peaks

WEI Zhao-hui,ZHANG Zhen-yu*,SUN Fu-bao*

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education,Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology of the Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

A method of high performance liquid chromatography(HPLC) with fluorescence detector(FLD) was developed for the simultaneous determination of 5 substances in the microbial enzymatic reaction system ofL-alanyl-L-glutamine,includingL-alanyl-L-glutamine,L-glutamine,L-alanine methyl ester,L-glutamic acid andL-alanyl-L-alanine.Standard substances and samples were derivated with phthaldialdehyde(OPA) by online automated precolumn derivatization.The analytes were separated on a C18column using acetonitrile(12%) and 12.5 mmol/L potassium phosphate buffer(88%,pH 7.4) as mobile phase by isocratic elution and analyzed quantitatively by the external standard method at an excitation wavelength of 338 nm and an emission wavelength of 450 nm.The flow rate was set at 1 mL/min and the column temperature was 40 ℃.The calibration curves for five standard substances were all linear in a broad range with correlation coefficients more than 0.999 4.The average recoveries of five substances at three spiked levels ranged from 93.5% to 104.9% with relative standard deviations(RSDs) less than 7%.Injecting six times every two hours one day,the RSD values of retention time for five substances were all less than 0.12%,and the RSD values of peak area of five substances were all less than 1.2%.The method was simple,sensitive,accurate and repeatable with a high resolution.

high performance liquid chromatography(HPLC);online automated precolumn derivatization;the reaction system ofL-alanyl-L-glutamine;sample preparation

2016-03-23；

2016-04-13

國家自然科學基金(30970058，21176106)；江蘇省自然科學基金(BK2012554)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.017

O657.72

A

1004-4957(2016)10-1317-06

*通訊作者：張震宇，博士，教授，研究方向：發酵工程與分子生物學，Tel:0510-85327026，E-mail:zhangzy@jiangnan.edu.cn

孫付保，博士，副教授，研究方向：藥用氨基酸及其衍生物的微生物酶法制造，Tel:0510-85327026，E-mail:fubaosun@jiangnan.edu.cn