油桐枯萎病病原鑒定及其生物學特性研究

徐紅梅 曾祥福 鄧先珍 杜洋文

摘要：本研究對湖北省武陵山區油桐枯萎病進行了病原菌分離與鑒定、致病性測定、病原菌生物學特性等研究。結果表明：油桐枯萎病病原菌為尖鐮孢。該病原菌在10～40 ℃溫度范圍均能生長，最適生在溫度為25～30 ℃；在酸性、中性和堿性土壤條件下均能生長，但在弱酸性條件下生長最好。該病原菌能利用環境中的多種碳源和氮源。室內毒力測定結果表明，5種供試殺菌劑對病原菌抑菌效果不同，50%多菌靈超微可濕性粉劑抑菌率最高。

關鍵詞：油桐；病原鑒定；生物學特性；毒力測定

中圖分類號：S763.1文獻標識碼：A文章編號：1004-3020（2016）05-0042-04Pathogen Identification and Biological Characteristics of Tungoil Tree PestilenceXu Hongmei（1）Zeng Xiangfu（1，2，3，4）Deng Xianzhen（1，2，3，4）Du Yangwen（1，2，3，4）

（1.Hubei Academy of ForestryWuhan430075；2.Hubei Provincial Engineering Technology Research Center of

Woody OilBearing ForestWuhan430075；3.Hubei Collaborative Innovation Center for Exploiting Characteristic

Resources in Dabie MountainsHuanggang438000；4.Hubei Key Laboratory of NonTimber

Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive UtilizationWuhan430075）

Abstract： Pathogen identification and biological characteristics of Tungoil Tree Pestilence in Wuling Mountainous Area in Hubei Province was studied in this paper.It showed Fusarium oxysporum was the pathogen.The mycelia could grow in the temperature ranging from 10℃ to 40℃，and optimum temperature ranged from 25 ℃ to 30 ℃.The pathogen could grow in acid， neutal and alkaline soil with the highest growth in weak acid soil.The pathogen could absorb many kinds of carbon and nithogen source in the enviroment.Toxicity of five kinds of fungicides to the pathogen was tested in the lab.Different fungicides inhibit the growth of mycelia in different levels， and 50% carbendazim WP showed best effect.

Key words：Aleurites fordii ； pathogen identification； biological characteristics； toxicity test

油桐Vernicia fordii是大戟科油桐屬植物統稱，為著名的的工業油料樹種。武陵山區自然條件適于種植油桐，在歷史上一直是中國桐油中心產區，油桐產業是該區重要的特色資源產業＼[1＼]。

病蟲害防治是油桐生產栽培中的一項重要內容，發生較嚴重的典型病害有油桐枯萎病、黑斑病、根腐病和炭疽病等[2]。對于這些油桐病害的深入研究，可查閱文獻并不多。油桐枯萎病在油桐產區發生普遍，發生嚴重時可造成重大損失。部分學者對油桐枯萎病進行了研究，包括病原菌鑒定、病害發生規律、感病植物生理生化和抗性株系選育等內容＼[3-6＼]。油桐枯萎病研究十分薄弱，主要涉及病原菌鑒定[7]。2015年6～10月，作者對湖北省來鳳縣油桐林（三年桐）病蟲害進行了初步調查，該地油桐病蟲害發生較為頻繁，其中油桐枯萎病和黑斑病較為嚴重。油桐枯萎病病癥主要表現為葉片枯黃，較早脫落，但是油桐根系無明顯癥狀。本文對油桐枯萎病病原進行了初步鑒定和生物學特性研究，以期為病害發生規律及防治研究提供理論依據。

1材料和方法

1.1病原物分離

供試材料為湖北省來鳳縣百福司鎮沙道灣村油桐枯病發病葉片，2015年7月、9月分別采集樣品1次。采用組織分離法進行病原物分離工作。

用無菌剪刀在病健交界處剪取約1 cm2組織塊，70%酒精中浸1 s后在01%升汞中消毒180～240 s，無菌水換洗3次。用無菌鑷子將其移至PDA（馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL）平板培養基上，每皿均勻分布3～5段。翻轉培養皿，使皿底向上，置于25 ℃恒溫箱中。培養2～3 d后，將植物組織周圍長出的菌絲體轉接至新的PDA平板上進行純化。觀察記錄各純化菌株培養性狀后保存于4℃冰箱備用。

1.2致病性測定

依據柯赫氏法則，測試各純化菌株的致病性。油桐健康葉片源自湖北省林科院九峰油桐示范林。剪取健康葉片，放入保鮮盒中，取長滿平皿的菌絲塊緊貼在葉片表面，對照組加無菌培養基塊，25 ℃恒溫培養，保持90%相對濕度。48 h后觀察葉片發病情況，并記錄發病癥狀。將發病葉片進行組織分離，獲得再分離菌株，與原接種菌株進行比較。

1.3病原菌鑒定

將病原物接種在PDA平板上，25 ℃培養3 d，觀察記錄菌落形態特征，主要包括生長速度、菌絲顏色、是否有氣生菌絲、菌落結構及色素產生情況等。挑取菌絲體，在光學顯微鏡下觀察菌絲體形態、產孢結構、厚垣孢子的有無和產生方式及分生孢子形態、顏色、大小等特征。參考文獻資料＼[8-9＼]對病原菌形態進行鑒定。

病原物基因組提取采用微波爐裂解法。核糖體DNA內轉錄間隔區（ITS1-5.8S-ITS2）基因擴增采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[10]。PCR擴增反應條件為：94℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，36次循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR 產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。病原物ITS基因序列進行BLAST比對后獲得多個匹配的序列記錄，用CLUSTAL X軟件包進行多序列比對。

1.4病原菌生物學特性研究

1.4.1溫度對病原菌菌絲生長的影響

將保存備用的菌株在25 ℃恒溫箱中預培養3 d，于菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，接種于PDA平板上，分別置于10，15，20，25，30，35，40 ℃恒溫箱中培養，每個處理重復3次，4 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.2pH值對病原菌菌絲生長的影響

用1 mol·L-1HCL和1 mol·L-1NaOH調節PDA培養基的pH值至4，5，6，7，8，9（酸度計測量pH值）。按1.4.1所述方法分別接種菌餅于不同pH值PDA培養基，置于25℃恒溫箱中培養。每個處理重復3次，4 d后測量菌落直徑。

湖北林業科技第45卷第5期徐紅梅，等：油桐枯萎病病原鑒定及其生物學特性研究1.4.3碳源和氮源對病原菌菌絲生長的影響

以查彼培養基為基礎培養基（硝酸鉀20 g，磷酸氫鉀10 g，氯化鉀05 g，硫酸鎂05 g，硫酸亞鐵001 g，蒸餾水1 000 mL）。供試碳源為葡萄糖300 g，甘露醇276 g，可溶性淀粉2455 g，麥芽糖2725 g，蔗糖259 g，果糖2725 g（用量以葡萄糖300 g含碳量109 g為標準進行換算），滅菌后接種，以無碳源處理作為對照。每個處理重復3次，置于25 ℃恒溫箱中培養，4 d后測量菌落直徑。

供試氮源為硝酸鉀100 g，尿素30 g，硫酸銨66 g，甘氨酸75 g，硝酸銨40 g（用量以硝酸鉀100 g的含氮量14 g為標準進行換算），滅菌后接種，以無氮源處理作為對照。每個處理重復3次，置于25 ℃恒溫箱中培養，4 d后測量菌落直徑。

1.4.4不同殺菌劑對病原菌菌絲生長的毒力測定

在無菌操作條件下，將供試殺菌劑分別用無菌水稀釋成所需濃度10倍于供試濃度的5個系列濃度梯度的藥液。向培養皿中加入藥液1 mL，再加入9 mL冷卻至50～60 ℃的PDA培養基，充分混勻，最終配制成所需濃度的含藥培養基，以不含藥劑的培養基作為對照，每個濃度重復4次。供試藥劑和使用濃度見表1。

采用生長速率法對菌絲生長進行室內毒力測定[11]：在每個含藥劑平板中央接入一塊直徑為5 mm的菌餅，25 ℃恒溫箱中培養4 d后測量菌落直徑，根據以下公式計算各藥劑濃度對菌絲生長的抑制率。所得數據經SPSS170統計軟件進行數據處理，求出各藥劑毒力回歸方程、EC50及相關系數。

抑菌率（%）=對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑-菌餅直徑×100%表1供試藥劑和使用濃度表殺菌劑名稱生產廠家使用濃度/（μg·mL-1）125%氟環唑懸乳劑西班牙巴斯夫歐洲公司50，25，125，625，31343%戊唑醇懸乳劑澳大利亞拜耳作物科學公司25，125，625，313，1650%多菌靈超微可濕性粉劑山東綠豐農業有限公司125，625，313，16，0870%代森錳鋅可濕性粉劑山東富先達農藥有限公司250，125，625，3125，156275%百菌清可濕性粉劑山西華農生物化學有限公司100，50，25，125，6252結果和分析

2.1病原物分離培養

病葉組織在PDA平板上培養3 d后即可見菌絲在其邊緣長出。經過純化后共獲得5個純培養菌株。

2.2致病性測定

對5個菌株進行致病性測定，結果顯示1個菌株對油桐健康葉片有強致病性。葉片接種3 d后出現褐色病斑，病斑形狀不規則，在25 ℃恒溫和高濕環境下，病斑擴展迅速，15 d后部分供試嫩葉整葉褐化壞死。發病葉片組織分離后所得再分離菌株與接種菌株特征一致，符合柯赫氏法則。

2.3病原菌鑒定

該強致病力菌株氣生菌絲發達，白色絨絮狀，有明顯的分枝和分隔，能分泌紫紅色素。產生大小兩型分生孢子。作者結合病原物培養性狀、形態學特征和rDNAITS基因序列比對結果將其初步鑒定為尖鐮孢Fusarium oxysporum。

2.4病原菌生物學特性

2.4.1溫度對病原菌菌絲生長的影響

結果表明，該菌在10～40 ℃溫度范圍均能生長，25～30 ℃菌絲生長較快，其中25 ℃為最適生長溫度，培養4 d后菌落平均直徑為850 mm。高溫和低溫均不利于菌絲生長。當溫度低于10 ℃或者高于40 ℃時，菌絲生長速度緩慢（圖1）。

2.4.2pH值對病原菌菌絲生長的影響

結果表明，該菌可以在pH值4～9范圍內生長，pH值5～7時菌落生長速度較快，其中pH值為6是最適生長pH值，菌落平均直徑為563 mm。pH值大于7時，隨著pH值的升高，菌落的生長速度逐漸降低（圖2）。

2.4.3碳源和氮源對病原菌菌絲生長的影響

該菌在供試5種碳源培養基中均能生長，菌落直徑遠大于缺碳對照，在蔗糖培養基上菌落直徑最大，平均直徑為686 mm，其次是甘露醇、葡萄糖、淀粉和麥芽糖。不同碳源培養基上菌落培養性狀差異不大，蔗糖為該菌菌絲生長的最佳碳源（圖3）。

從圖4可以看出：該菌在供試5種氮源培養基中均能生長，菌落直徑大于缺氮對照，在硝酸鉀培養基上生長速度最快，菌落平均直徑達到407 mm，其次是甘氨酸、硝酸銨、硫酸銨和尿素。不同氮源培養基上菌落培養性狀差異不大，硝酸鉀為該菌菌絲生長的最佳氮碳源。

2.4.4不同殺菌劑對病原菌菌絲生長的影響

室內毒力測定結果表明，供試5種殺菌劑對該病原菌毒力不同，從大到小依次為：50%多菌靈超微可濕性粉劑﹥43%戊唑醇懸乳劑﹥125%氟環唑懸乳劑﹥75%百菌清可濕性粉劑﹥70%代森錳鋅可濕性粉劑。50%多菌靈超微可濕性粉劑對該病原菌的抑制效果最好，70%代森錳鋅可濕性粉劑效果最差，各殺菌劑對油桐枯萎病的室內毒力測定結果見表2。表2供試藥劑對油桐枯萎病病原菌毒力測定結果處理毒力回歸方程相關系數EC50/（μg·mL-1）12.5%氟環唑懸乳劑y=0.591x+4.2060.95822.0243%戊唑醇懸乳劑y=0.556x+4.1120.87911.4150%多菌靈超微可濕性粉劑y=7.960x+0.2670.81753.9270%代森錳鋅可濕性粉劑y=0.447x+4.0320.975144.4975%百菌清可濕性粉劑y=1.008x+3.1580.95367.053結論與討論

本文對湖北省武陵山區油桐枯萎病開展了病原菌分離與鑒定、致病性測定、病原菌生物學特性等研究，為該病害的發生規律和防治研究提供理論依據。組織分離所獲得的5個菌株經致病性測定，有1個菌株為油桐枯萎病強致病菌。依據該強致病病原菌形態學特性及rDNA-ITS序列比對結果，鑒定油桐枯萎病的病原菌為尖鐮孢。生物學特性研究表明，該病原菌在10～40 ℃溫度范圍均能生長，最適生在溫度為25～30 ℃；病原菌在pH值4～9可以生長，pH值5～7時菌落生長速度較快，表明病原菌在酸性、中性和堿性土壤條件下均能生長，但在弱酸性條件下生長最好。該病原菌能利用環境中的多種碳源和氮源，蔗糖和硝酸鉀分別為該菌菌絲生長的最佳碳源和氮源，因此在生產管理中應注意合理施肥。總體說來，油桐枯萎病病原菌對環境適應能力很強，該生物學特性為其容易侵染和傳播奠定了基礎。

室內毒力測定結果表明，供試5種殺菌劑對該病原菌毒力不同。毒力較強殺菌劑為：50%多菌靈超微可濕性粉劑、43%戊唑醇懸乳劑和12.5%氟環唑懸乳劑；毒力較差殺菌劑為：75%百菌清可濕性粉劑和70%代森錳鋅可濕性粉劑。生產過程中可以參考本研究結果，選擇50%多菌靈超微可濕性粉劑等殺菌劑防治油桐枯萎病。

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