電針對高脂喂養大鼠主動脈內皮細胞JNK蛋白的影響

張弘弢 藍丹純 李知行 許能貴 孫 健 易 瑋

(廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405)

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電針對高脂喂養大鼠主動脈內皮細胞JNK蛋白的影響

張弘弢 藍丹純 李知行1許能貴 孫 健2易 瑋

(廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405)

目的 觀察電針對高脂喂養大鼠主動脈內皮細胞c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白的影響。方法 將24只雄性SD大鼠隨機分為空白組、模型組、電針組8只。空白組予普通飼料喂養，模型組與電針組予高脂飼料喂養。造模8 w后，空白組、模型組繼續如前喂養不進行干預，電針組予針刺雙側內關、三陰交、足三里及腎俞，雙側足三里及三陰交加電。干預4 w后，用葡萄糖氧化酶法、ELISA及Western印跡檢測并比較各組大鼠空腹胰島素(FINS)、空腹血糖(FPG)、穩態模型評價的胰島素抵抗(IR)指數(HOMA-IR)以及主動脈內皮細胞JNK蛋白的表達及其磷酸化水平。結果 與模型組比較，電針組FPG、FINS、HOMA-IR均顯著降低(P<0.01)，而與空白組比較差異不顯著(P>0.01)；與模型組相比較，電針組的JNK蛋白表達及其磷酸化水平顯著降低(P<0.01)，與空白組比較差異不顯著(P>0.01)。結論 電針治療能調節血管內皮細胞JNK蛋白表達及其磷酸化水平，使其降至正常水平，從而改善IR大鼠的IR狀態，增強IR大鼠胰島素的敏感性。

電針；胰島素抵抗；JNK蛋白

胰島素抵抗(IR)在眾多心血管疾病的危險因素中處于重要地位,同時也在多種代謝異常類疾病的發病過程中發揮重要作用〔1〕。而C-jun氨基末端激酶(JNK)是調節胰島素信號轉導的重要信號分子〔2〕，在IR形成過程中發揮重要作用。針灸作為我國傳統醫學的一部分，其多水平、雙向調節的作用在改善IR方面具有優勢，既往研究也證實電針能有效改善IR〔3〕。血管內皮細胞是胰島素的重要靶器官，本研究以血管內皮細胞為靶點，通過觀察大鼠血管內皮細胞空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)以及JNK蛋白及其磷酸化水平的改變，探討并完善電針改善IR狀態的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及飼料 選用體重120～140 g的6周齡SPF級雄性SD大鼠，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。飼養及實驗過程在屏障實驗環境之中。實驗環境要求室溫18℃～22℃，相對濕度40%～85%；光照：12 h明/12 h暗，照度：150～300 Lx，每日手動開關。普通飼料配方(質量比)：豆粕21%，小麥18%，麩皮10%，玉米31%，魚粉6%，稻谷4%，蛋黃粉3%，預混料3.5%，黃豆2%，植物油1.5%，多種維生素1%，由實驗動物中心提供。高脂飼料配方(質量比)：脂肪34.9%，蛋白質26.2%，碳水化合物26.3%，由實驗動物中心提供D12492號飼料。實驗過程遵循實驗室動物護理和使用的倫理準則。

1.2 設備與試劑 SAPK/JNK抗體購買于CST廠家，FINS測定試劑盒購自默科迪亞公司；電針儀選用上海華誼醫用儀器有限公司生產的G6805-2A型低頻電子脈沖治療儀(YZB/滬0735-26-2009)；一次性無菌針灸針選用華佗牌，規格：0.35 mm×13 mm。

1.3 方法

1.3.1 分組與實驗操作 選用SPF級SD大鼠24只，適應性喂養1 w，隨機分為正常組(8只)、高脂組(16只)。兩組分別給予普通飼料，高脂飼料喂養。8 w后，檢測實驗動物FPG、FINS，計算IR指數(HOMA-IR)，以評測模型是否成功建立。模型建立成功后，模型組隨機分為模型組(8只)、電針組(8只)。電針組，取雙側足三里、三陰交、內關、腎俞，疏密波(密波50 Hz，疏波2 Hz，頻率10次/min)，強度以大鼠后肢輕微抖動為度，20 min/次，1次/d，持續4 w。空白組與模型組采用與電針組相同的按壓固定時間，其余不做干預，繼續如前喂養。

1.3.2 標本采集與檢測 針刺療程治療結束后，禁食不禁水12 h，于次日晨麻醉后行眼眶靜脈竇采血。FPG用葡萄糖氧化酶法測定;FINS采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，按說明書進行操作測定;脫臼法處死，并從腹主動脈灌注多聚甲醛固定，快速取主動脈置于-20℃保存，Western印跡方法檢測SAPK/JNK蛋白表達及其磷酸化水平。HOMA-IR參照Haffner簡化Matthews的計算方法〔4,5〕，即HOMA-IR=ln(FPG×FINS/22.5)。

1.4 統計方法 采用SPSS19.0軟件，采用單因素方差分析，方差齊用LSD比較，若方差不齊用Tamhane比較。

2 結 果

2.1 電針對大鼠IR的影響 與空白組相比，模型組的FPG、FINS、HOMA-IR顯著升高(P<0.01)；而電針治療后，電針組的FPG、FINS、HOMA-IR較模型組顯著降低(P<0.01)。見表1。

2.2 電針對主動脈內皮細胞JNK蛋白的表達及其磷酸化水平的影響 與空白組比較，模型組的JNK蛋白及其磷酸化水平顯著升高(P<0.01)；治療后，電針組的JNK蛋白及其磷酸化水平較模型組顯著降低(P<0.01)。見表2。見圖1。

表1 各組大鼠FPG、FINS及HOMA-IR的比較

與空白組比較:1)P<0.01，與模型組比較:2)P<0.01；下表同

表2 各組大鼠JNK蛋白及其磷酸化水平比較

圖1 3組主動脈內皮細胞JNK及p-JNK蛋白表達

3 討 論

IR與多種代謝異常類疾病的發病密切相關，而JNK蛋白則在IR形成過程中發揮重要作用。胰島素信號轉導過程中，胰島素與靶細胞表面的胰島素受體結合，使胰島素受體β亞基酪氨酸激酶發生磷酸化而被激活，激活后的酪氨酸激酶能磷酸化IRS，進而激活磷脂酰肌醇3-激酶活性以調節不同的代謝通路〔6〕。IRS是胰島素信號轉導過程中的重要組成部分和關鍵環節。JNK是MAPK超家族中的一員，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。JNK被激活后，能引起IRS-1第307位絲氨酸磷酸化，使IRS-1對胰島素信號的轉導起負向調節，減弱機體組織對胰島素的敏感性〔7〕。在2型糖尿病患者和糖尿病、非酒精性肝炎等多種代謝異常疾病的實驗動物模型中，均能發現其組織中的JNK活性明顯升高。而無論是通過JNK結構域反義多肽序列抑制JNK蛋白活化、JNK基因敲除，還是RNAi技術沉默JNK基因的表達，均能發現實驗動物模型組織胰島素敏感性明顯提高，IR狀態顯著改善〔8〕。IR在傳統中醫理論中認為其病機乃 “脾腎兩虛、痰瘀阻絡”，治療原則為標本兼治，治法當培補脾腎、祛痰化瘀通絡。故選取足三里、內關、三陰交、腎俞穴為主穴治療。足三里是足陽明胃經中五腧穴之合穴且為胃之下合穴，能健脾化痰，補益中氣；內關為手厥陰心包經的絡穴，與三焦經相通，能理臟腑之氣機；三陰交為足厥陰肝、足太陰脾、足少陰腎三條陰經的交會穴，聯絡三條經絡之氣血，能調補肝腎，健脾益氣，疏經通絡。腎俞是足太陽膀胱經中腎之背俞穴，能補先天之腎氣。且其中足三里、三陰交、內關三穴是靳瑞教授在臨床上治療糖尿病、肥胖等代謝異常疾病有顯著療效的經驗組穴。諸穴標本兼治，共奏“培補脾腎、祛痰化瘀通絡”之功。

電針改善IR的內在機制可能與其干預胰島素信號轉導通路有關。研究發現，針刺胰島素抵抗鼠，其骨骼肌IRS-1、IRS-2的表達增多，且骨骼肌PI3K-p85α mRNA及其蛋白的表達被抑制，而PI3K的活性增強；同時IR鼠骨骼肌中phospho-PKCζ/λ mRNA和Akt2 mRNA的表達亦有增加，從而改善大鼠骨骼肌的IR狀態〔9,10〕。亦有研究表明，電針通過干預IR大鼠骨骼肌JNK蛋白的表達，降低JNK的活性，減少胰島素受體底物磷酸化，從而改善IR狀態〔11〕。近年來，作為胰島素的重要靶器官之一的血管內皮細胞備受關注，關于針刺改善血管內皮細胞IR的研究也日益增多，如陳婧〔12〕通過針刺自發性IR模型——OLETF大鼠，觀察血管內皮細胞與IR的變化發現，針刺干預下調了IR模型大鼠TNF-α的表達,同時抑制MAPK-P38信號通路的激活,從而進一步降低TNF-α的表達,使胰島素受體的活性增強,機體對胰島素的敏感性亦有增強。為進一步完善其作用機制，結合以上研究，考慮電針改善血管內皮IR是否與JNK蛋白有關。 本次實驗結果說明電針能有效改善實驗大鼠IR狀態，再次驗證了既往的研究結果。高脂飲食喂養大鼠，經多種途徑激活了大鼠血管內皮細胞的JNK，使JNK蛋白表達及其磷酸化水平明顯增加，從而干預胰島素信號傳導通路，引起大鼠IR。電針治療能調節血管內皮細胞JNK蛋白表達及其磷酸化水平，使其降至正常水平，從而改善IR大鼠的IR狀態，增強IR大鼠胰島素的敏感性。

1 陳春紅,傅向華.胰島素抵抗與冠心病的關系及其機制的研究進展〔J〕.河北職工醫學院學報,2006;23(2):47.

2 Sharfi H,Eldar-Finkelman H.Sequential phosphorylation of insulin receptor substrate-2 by glycogen synthase kinase-3 and c-Jun NH2-terminal kinase plays a role in hepatic insulin signaling〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab,2008;294(2):E307-15.

3 王靜芝，王 華，周煥嬌，等.電針對胰島素抵抗模型大鼠下丘腦IRS-2和Akt2 mRNA表達的影響〔J〕.中華中醫藥雜志，2014；10：3243-6.

4 Matthews DR,Hosker JP,Rudenski AS,etal.Homeostasis model assessment:insulin resistance and beta-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man〔J〕.Diabetologia,1985;28(7):412-9.

5 Haffner SM,Kennedy E,Gonzalez C,etal.A prospective analysis of the HOMA model.The Mexico City Diabetes Study〔J〕.Diabetes Care,1996;19(10):1138-41.

6 Yang R,Trevillyan JM.c-Jun N-terminal kinase pathways in diabetes〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2008;40(12):2702-6.

7 趙 斌.JNK通過抑制胰島素信號通路介導了高糖和軟脂酸誘導的胰島β細胞凋亡〔D〕.上海：上海交通大學,2008.

8 Hirosumi J,Tuncman G,Chang L,etal.A central role for JNK in obesity and insulin resistance〔J〕.Nature,2002;420(3):333-6.

9 張 梁,易 瑋.針刺對胰島素抵抗模型大鼠骨骼肌胰島素受體底物和葡萄糖轉運蛋白4的影響〔J〕.廣州中醫藥大學學報,2015;(4):699-704.

10 張 梁.針刺對胰島素抵抗模型大鼠干預的信號轉導機制研究〔D〕.廣州：廣州中醫藥大學,2010.

11 唐思詩,唐念珍,唐成林,等.電針刺激對胰島素抵抗大鼠骨骼肌ERK及JNK蛋白表達的影響〔J〕.實用中醫藥雜志,2015；30(4):268-70.

12 陳 婧.針剌對胰島素抵抗模型大鼠血管內皮MAPK-P38信號通路的影響〔D〕.廣州：廣州中醫藥大學,2015.

〔2016-07-26修回〕

(編輯 曲 莉)

Effect of electroacupuncture on the expression of JNK protein in aorta of rats with high fat induced insulin resistance

ZHANG Hong-Tao,LAN Dan-Chun,LI ZHi-Xing,et al.

Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510405,Guangdong,China

Objective To investigate the effect of electroacupuncture(EA)on the expression of JNK protein in aorta of rats with high fat induced insulin resistance.Methods 24 male SD rats were randomly divided into blank,model and EA groups,with 8 rats in each group.Rats in blank group were fed with normal diet,rats in model and EA groups were fed with high fat diet.After 8 weeks,rats in EA group were applied to bilateral Neiguan(PC6),Zusanli(ST36),Sanyinjiao(SP6)and Shenshu(BL23)for 4 weeks.Needles in Zusanli(ST36),Sanyinjiao(SP6)were connected with EA.At the end of the treatment,glucose oxidase method and ELISA were used to detect the fasting plasma glucose(FPG),fasting serum insulin(FINS)and homeostasis model assessment-insulin resistance(HOMA-IR)was calculated.The expression of JNK protein and the phosphorylation protein were determined by using Western blot.Results Compared with model group,the FPG,FINS and HOMA-IR in the EA group were significantly decreased(P<0.01).After treatment,the FPG,FINS and HOMA-IR in the EA group were significantly lower than those of model group(P<0.01)and the expression of p-JNK/JNK of rats in EA group was significantly decreased than that of model group(P<0.01).Conclusions EA could improve insulin sensitivity of rats with high fat induced insulin resistance,which might be related to regulating the expression of JNK protein and its phosphorylation level.

Electroacupuncture;Insulin resistance;JNK protein

國家自然科學基金資助項目(No.81273845)

易 瑋(1966-)，女，教授，博士生導師，主要從事針灸治療代謝性疾病研究。

張弘弢(1992-)，男，在讀碩士，主要從事針灸治病機制研究。

R245.31+1

A

1005-9202(2016)21-5220-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.002

1 深圳市中醫院 2 廣東省中醫院