Alpha-突觸核蛋白寡聚體致帕金森病小鼠模型的行為學變化

王 鵬 歷 春 王海鵬 蓋曉東

(北華大學基礎醫學院人體解剖學教研室，吉林 吉林 132013)

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Alpha-突觸核蛋白寡聚體致帕金森病小鼠模型的行為學變化

王 鵬 歷 春1王海鵬 蓋曉東1

(北華大學基礎醫學院人體解剖學教研室，吉林 吉林 132013)

目的 觀察家族型帕金森病(PD)alpha-突觸核蛋白(α-Syn)突變體A53T和A30P寡聚體導致小鼠PD模型的行為學變化，探討α-Syn寡聚體在體內的神經毒性作用。方法 制備野生型α-Syn、家族型突變體A53T和A30P的聚集體，對C57BL/6小鼠進行紋狀體注射。培養至第30、60天，進行爬桿實驗、懸吊實驗、滾軸實驗和平衡木實驗評估行為學改變。免疫組織化學方法檢測黑質多巴胺能神經元改變。結果 實驗鼠紋狀體α-Syn寡聚體注射后30 d出現PD樣運動障礙表現，紋狀體注射30 d和60 d后，各組小鼠的爬桿實驗結果均與對照組無差異(P>0.05)。注射30 d后，野生型α-Syn寡聚體組小鼠平衡木實驗、懸掛實驗、滾軸實驗與對照組無差異(P>0.05)；A53T和A30P組小鼠平衡木時間比對照組長(P<0.05)，滾軸上時間比對照組小鼠縮短(P<0.05)，懸掛評分比對照組明顯降低(P<0.01)，與野生型α-Syn寡聚體組相比有統計學差異(P<0.05)。注射60 d后，野生型α-Syn寡聚體組小鼠平衡木實驗平均通過時間比對照組小鼠長(P<0.05)、懸掛實驗評分較對照組小鼠降低(P<0.05)；A53T和A30P組小鼠各項行為學評估與對照組小鼠差異顯著(P<0.01)、與野生型α-Syn寡聚體組相比有差異(P<0.05)。A53T和A30P組小鼠黑質多巴胺能神經元數目下降(P<0.05)。結論 紋狀體注射α-Syn突變體A53T和A30P寡聚體,模型小鼠出現PD樣行為學改變和黑質多巴胺能神經元減少。

帕金森病；alpha-突觸核蛋白；寡聚體

帕金森病(PD)是以神經元內路易體(LB)為主要病理特征的神經變性病〔1〕。而alpha-突觸核蛋白(α-Syn)作為LB的主要成分，被認為是引起PD發病的關鍵性蛋白〔2〕。研究證實，存在于LB中的α-Syn大部分發生錯誤折疊而聚集〔3〕。外源性α-Syn的寡聚體進入神經元后，可引起進一步聚集，形成不可溶的淀粉樣變性包涵體〔4〕。一些家族性PD患者α-Syn基因突變引起α-Syn錯譯發生結構變化而易于聚集，其中以第88位堿基發生G-C突變，導致氨基酸序列第30位丙氨酸變成脯氨酸(A30P)，第209位核苷酸發生G-A突變，使氨基酸序列中第53位丙氨酸變成蘇氨酸(A53T)最常見〔5，6〕。我們已證實α-Syn突變型A53T和A30P的寡聚體可以進入神經元，并較野生型α-Syn寡聚體對神經元的毒性更大、在神經元內形成LB樣嗜酸性包涵體。如能利用其神經毒性制作動物模型，對PD的發病機制研究意義重大。本研究利用α-Syn寡聚體神經元感染的特點，對實驗動物進行紋狀體注射，觀察其行為學變化，探討在短時間內構建PD動物模型的可能，并進一步研究α-Syn 家族型突變體A53T和A30P寡聚體在體內的神經毒性作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 組織包埋劑(SAKURA Tissue-Tek?O.C.T.Compound)，購自美國SAKURA公司；α-Syn 單克隆抗體(ab138501)，購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG，購自北京中杉金橋生物有限公司；TH抗體，購自美國Abcam公司。

1.2 實驗動物 C57BL/6小鼠，雄性，8周齡，重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證：SCXK(京)2013-0001。動物訂購后，在26 cm×18 cm×18 cm籠箱內、每籠5只適應性培養7 d后，進行體重測量和紋狀體注射的預實驗操作。之后進行相應實驗操作和按照實驗動物飼養標準進行正常飼養。動物實驗操作流程經實驗動物倫理學委員會批準，動物試驗操作者持有實驗動物人員崗位證書，證書編號39749。共4組，假手術組、野生型α-Syn寡聚體組、A53T寡聚體組、A30P寡聚體組。每組8只。均采用左側紋狀體側注射。實驗組每只注射5 μg寡聚體〔7〕，體積為2 μl，假手術組注射2 μl PBS。

1.3 方法

1.3.1 紋狀體注射 小鼠稱重，10%水合氯醛0.004 ml/g體重進行腹腔注射麻醉。將小鼠頭顱水平位固定在腦立體定位儀上，距離前囟冠狀位中線向前0.8 mm、前囟外側緣2.0 mm、距離硬腦膜深約3.0 mm、開骨窗，注射樣品，用牙托粉封閉顱骨孔。然后縫合筋膜和皮膚，并于腹腔注射氨芐青霉素8萬U，術后小鼠包被保暖，清醒后置于籠內正常飼養。

1.3.2 動物行為學觀察 通過爬桿實驗、懸吊實驗、滾軸實驗和平衡木實驗反映肌力、平衡和協調能力。分別在實驗前先訓練大鼠3 d，然后開始正式實驗。在紋狀體注射前、注射第30、60天由經過正式培訓的實驗人員通過雙盲原則完成行為學測試。

1.3.2.1 爬桿實驗 參照Ogawa等〔8〕的測試方法，自制直徑0.8 cm、高60 cm 的直木桿，桿頂部有一小木球，外面覆蓋紗布以防止小鼠打滑。小鼠被頭向上放于桿頂端，記錄動物從開始運動到完全轉為頭向下的時間和它們下到桿底的時間。

1.3.2.2 懸掛實驗 參照Kuribara等〔9〕的測試方法，自制懸掛桿，水平放置，距地面30 cm。實驗中小鼠懸掛于金屬桿上，如小鼠用兩后爪計3分，如用一后爪抓住電線計2分，如小鼠兩后爪均抓不住電線計1 分，最后計算得分情況，測5次取平均值。

1.3.2.3 滾軸實驗 采用小鼠電動轉軸儀(Rotamex-5，Columbus Instruments)，滾軸直徑6 cm，轉速20 r/min，連續測20次取平均值〔10〕。

1.3.2.4 平衡木實驗 105 cm × 4 cm × 3 cm長木桿，木桿離地80 cm，兩端由木架支撐。實驗時，將小鼠放在起始區面對鼠籠方向，同時開始計時，記錄小鼠走過起始區的時間(潛伏期)和小鼠走過整個平衡桿的時間〔11〕。先訓練3次，然后開始正式實驗。走3次取平均值。

1.3.3 免疫組織化學方法 將實驗小鼠灌注取腦，制備腦組織冰凍切片。將組織切片放入含0.3% Triton X-100的PBS中，4℃浸泡2～4 d；將組織切片在含有0.5% H2O2的PBS中處理30 min，去除內源性過氧化物酶。在含1% 山羊血清中封閉30 ～ 60 min。加入TH抗體(1∶1 000)，4℃過夜。PBST沖洗后，加入生物素化的山羊抗小鼠IgG，1∶1 000，室溫孵育2 h。將切片用Tris-HCl緩沖液漂洗后，放入含有DAB和H2O2的顯色劑中顯色。顯色完成后，將切片移入Tris-HCl緩沖液中終止顯色。貼片上，低溫烤干或自然干燥，然后在不同濃度的乙醇中逐次脫水，每次5 min，然后移入二甲苯中透明，每次3 min。準備好蓋玻片，封片劑封片。晾干后，觀察。

1.4 統計方法 采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析，并用Sigma-plot繪圖軟件作圖。

2 結 果

2.1 小鼠給予α-Syn寡聚體后的一般表現 紋狀體注射30 d后小鼠開始出現輕微震顫、運動減少，個別出現后肢張開、豎毛等改變；注射A53T和A30P組小鼠運動能力下降明顯，震顫增多，肢體僵硬，個別小鼠有步態不穩、反應遲緩的PD樣運動障礙表現。

圖1 C57BL/6小鼠爬桿實驗行為學觀察結果

2.2 行為學檢測 見圖1～圖4。紋狀體注射30 d和60 d后，各組小鼠的爬桿實驗結果均與對照組無差異(P>0.05)。注射30 d后，野生型α-Syn寡聚體組小鼠平衡木實驗、懸掛實驗、滾軸實驗與對照組無差異(P>0.05)；A53T和A30P組小鼠平衡木時間比對照組長(P<0.05)，滾軸時間比對照組小鼠縮短(P<0.05)，懸掛評分比對照組明顯降低(P<0.01)，與野生型α-Syn寡聚體組相比有統計學差異(P<0.05)。注射60 d后，野生型α-Syn寡聚體組小鼠平衡木實驗平均通過時間比對照組小鼠長(P<0.05)、懸掛實驗評分較對照組小鼠降低(P<0.05)；A53T和A30P組小鼠平衡木實驗平均通過時間、懸掛實驗評分和滾軸平衡時間均與對照組小鼠有顯著差異(P<0.01)、與野生型α-Syn寡聚體組相比有差異(P<0.05)。

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與α-Syn寡聚體組比較：3)P<0.05；下圖同圖2 C57BL/6小鼠平衡木實驗行為學觀察結果(n=8)

圖3 C57BL/6小鼠懸掛實驗行為學觀察結果(n=8)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與A53T組比較：3)P<0.05圖4 C57BL/6小鼠滾筒實驗行為學觀察結果(n=8)

2.3 黑質多皮胺能神經元免疫組織化學檢測 紋狀體注射第30天各組黑質組織染色正常，未發現多巴胺能神經元減少。第60天，野生型α-Syn寡聚體組小鼠腦黑質多皮胺能神經元較對照組減少約26.53%(P<0.05)；A53T和A30P組與對照組相比，黑質多皮胺能神經元數目明顯減少約56.34 %和53.21%(P<0.01)，存留神經元形態皺縮，突起減少，多巴胺能神經纖維密度減低，見圖5。

標尺：20 μm圖5 寡聚體組小鼠腦紋狀體注射同側黑質多巴胺神經元較對照組減少

3 討 論

在神經系統，細胞外源性可溶α-Syn寡聚體進入神經元內后可引起進一步聚集，形成不可溶的淀粉樣變性包涵體〔12〕。這些變性蛋白形成的包涵體可以經細胞間的轉運感染正常細胞，使病變蔓延〔13〕。向PD患者腦黑質內移植胎兒中腦干細胞，結果顯示新移植的神經元細胞內也出現LB樣病變〔14〕，進一步證實了LB病變的可轉移性。本實驗結果證實，在紋狀體注射的α-Syn寡聚體可以在神經元間傳遞的方式進入黑質，并導致黑質多巴胺能神經元的減少。

本文行為學實驗結果顯示，模型小鼠垂直運動能力未改變而出現懸掛能力減弱、滾筒保持平衡的時間縮短以及通過平衡桿時間延長等表現。在體內證實家族型α-Syn突變體A53T、A30P聚集體對神經元的毒性并具備制作PD模型的可能。良好的動物模型是探討PD發病機制和治療方案的基礎。已知PD主要發病機制是黑質多巴胺能神經元喪失、紋狀體多巴胺含量降低，而使膽堿能系統的功能相對亢進，造成紋狀體DA和乙酰膽堿遞質失衡。PD模型主要通過損毀的辦法破壞黑質-紋狀體DA系統，繼而產生PD樣遞質生化改變；藥物干擾Ach和DA的平衡，直接模擬PD的遞質變化；或通過轉基因動物，從發病機制、生化改變以接近人PD改變。但模型均未有PD特征性的病理變化LB形成。我們利用α-Syn寡聚體和家族型α-Syn突變體A53T和A30P進行紋狀體注射，發現模型小鼠出現PD樣行為學改變和黑質多巴胺能神經元減少，提供了PD模型制備的新方法。

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〔2015-12-19修回〕

(編輯 徐 杰)

吉林省科技廳項目(20150101128JC)

蓋曉東(1962-)，女，教授，碩士生導師，主要從事腫瘤分子病理學研究。

王 鵬(1977-)，男，博士，講師，主要從事人體解剖學和神經生物學基礎理論研究。

R74

A

1005-9202(2016)21-5227-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.005

1 北華大學基礎醫學院病理學教研室