氯胺酮誘導小鼠腦皮質神經細胞的凋亡及其機制

肖 莉 陳 靖 盛崴宣 馮 楓 陳立芳

(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，北京 100038)

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氯胺酮誘導小鼠腦皮質神經細胞的凋亡及其機制

肖 莉 陳 靖 盛崴宣 馮 楓 陳立芳

(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，北京 100038)

目的 探究氯胺酮誘導腦皮質神經細胞的凋亡及其機制。方法 分別用30、60、80、100 mg/ml氯胺酮分別處理小鼠腦皮質神經細胞6、12、18、24 h，采用MTT法檢測氯胺酮處理后小鼠皮質神經細胞的凋亡率；用100 mg/ml氯胺酮不用時間處理小鼠皮質神經細胞，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測處理前后皮質神經細胞LDH釋放率的變化；將不同處理后的神經細胞進行總蛋白提取，Western印跡法檢測GSK-3β蛋白的表達；用100 mg/ml氯胺酮處理后的小鼠皮質神經細胞18 h后采用流式細胞儀檢測處理后皮質神經細胞的凋亡。結果 30 mg/ml的氯胺酮處理6 h，細胞的凋亡率僅為(12.4±2.47)%，對照組沒有出現細胞凋亡，隨著濃度的增加和作用時間的延長，凋亡率逐漸增加；100 mg/ml氯胺酮處理24 h時小鼠神經細胞的抑制率達到最大值為(58.7±5.86)%。100 mg/ml的氯胺酮不用時間處理皮質神經細胞后LDH釋放率與氯胺酮作用時間呈正相關，其中18 h釋放率較大，24 h皮質神經細胞的LDH釋放率為(192±4.39)%，在6～24 h達到最大，約為6 h處理的1.8倍。6 h GSK-3β蛋白表達量升高，約為對照組的(105.4±4.13)%，12 h的GSK-3β蛋白表達量呈現較低水平為(118.7±3.56)%，18 h表達量明顯升高為(144.7±3.72)%，24 h為對照組的(197.3±4.36)%。與對照組相比，氯胺酮處理后的皮質神經細胞出現了大量的凋亡。結論 高劑量氯胺酮能夠誘發小鼠腦皮質神經細胞凋亡，可能與GSK-3β蛋白激活相關。

氯胺酮；皮質神經細胞；GSK-3β

全身麻醉是現代手術治療的輔助手段，可以減輕患者對手術的恐懼和痛苦〔1〕，但長期使用麻醉會對人的大腦神經系統產生一定的影響〔2〕。氯胺酮作為臨床上經常使用的麻醉劑，鎮痛效果極佳，體外組織培養實驗表明長期使用氯胺酮會誘導細胞凋亡，嚴重者導致神經衰退〔3〕。本文研究氯胺酮作用于皮質神經細胞后對乳酸脫氫酶(LDH)及GSK-3β表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試劑 體重約80 g的小鼠，由首都醫科大學實驗室飼養。B27培養基、DEME、雙抗、FBS，美國Gibco公司；胰酶、DMSO、Annexin-FITC、Propidiuym Iodide，Sigma公司；MTT，上海譜振生物科技有限公司；pierce-膜蛋白提取試劑盒，上海偉進生物科技有限公司；GSK-3β抗體，CST公司；LDH檢測試劑盒，碧云天生化科技有限公司；羊抗兔抗體，北京諾博萊德科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠神經細胞的培養 在超凈臺將小鼠的頭部用酒精消毒后，有手術刀切斷小鼠頭部，用無菌剪刀剪開小鼠頭部，小心取出小鼠的腦部，置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，去除表面血管，將皮質部分用剪刀剪成塊狀，加入0.25%的胰液中，37℃溫育10 min，反應終止后，將懸浮液800 r/min離心5 min，棄去上清，加入DEME培養液清洗細胞，800 r/min離心5 min，棄去上清后加入DEME培養液培養細胞37℃ 5%CO2，培養1 d后，離心后棄去上清培養液加入B27培養基，每2 d更換1次培養液，第6天時加入藥物進行處理。

1.2.2 MTT法檢測氯胺酮處理后小鼠皮質神經細胞的凋亡率 在已經培養6 d的細胞中加入氯胺酮進行處理小鼠皮質神經細胞，藥物濃度30、60、80、100 mg/ml，分別處理6、12、18、24 h。對照組為不加氯胺酮的神經細胞加入PBS溶液培養，實驗組加入20 μl MTT，室溫下反應4 h后，800 r/min離心3 min，棄去上清，加入200 μl DMSO，室溫反應10 min，540 nm下進行OD值測定，公式：凋亡率=(OD空白-OD樣品)/OD空白×100%。

1.2.3 氯胺酮處理后小鼠皮質神經細胞LDH釋放率 采用LDH試劑盒進行測定，在96孔細胞培養板內加入50 μl LDH底物，50 μl 不同處理的細胞上清液，黑暗下反應30 min，490 nm下測定吸光值為細胞上清中LDH釋放量。向原96孔板內加入溶解酶，37℃反應1 h，取50 μl 細胞反應液，加入50 μl LDH底物，避光反應30 min后，490 nm測定吸光值為神經細胞總LDH釋放量，細胞LDH釋放率=OD上清/OD總。

1.2.4 Western印跡法檢測GSK-3β蛋白的表達 將不同處理后的神經細胞離心后收集，參照細胞總蛋白提取試劑盒提取蛋白，在蛋白核酸分析儀上測定提取蛋白的濃度，取同等蛋白量20 μg，加入上樣緩沖液100℃變性失活，配制10%分離膠、4%濃縮膠，樣品進入濃縮膠電壓為80 V，進入分離膠后調電壓140 V，電泳結束后，將蛋白凝膠在NC膜 4℃進行轉膜，過夜反應后，加入脫脂牛奶4℃下封閉，取出PVDF膜，PBS 溶液清洗后加入一抗鼠抗GSK-3β，4℃孵育過夜，加入Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗3次，每次約10 min，加入稀釋后的標記羊抗兔抗體室溫下反應1 h，加入TBST清洗3次，每次約10 min。將PVDF膜放入凝膠成像儀中，保存圖片。

1.2.5 流式細胞儀檢測氯胺酮處理后皮質神經細胞的凋亡 將用100 mg/ml氯胺酮處理后的小鼠皮質神經細胞18 h，對照組細胞加入DMSO溶液，反應結束后用PBS溶液清洗細胞，800 r/min離心后細胞沉淀，加入Annexin-FITC和Propidiuym Iodide混勻，避光培養15 min，在流式細胞儀上檢測神經細胞凋亡。

1.3 統計學方法 應用SPSS19.0軟件行t檢驗，Pearson法進行相關性分析。

2 結 果

2.1 MTT法測定氯胺酮處理后小鼠皮質神經細胞的凋亡率 30 mg/ml的氯胺酮處理6 h，細胞的凋亡率僅為(12.4±2.47)%，對照組沒有出現細胞凋亡；隨著作用時間的延長，凋亡率逐漸增加，60 mg/ml組處理后的神經細胞凋亡率高于30 mg/ml；當氯胺酮濃度為100 mg/ml、處理時間為24 h，小鼠神經細胞的抑制率達到最大值為(58.7±5.86)%，神經細胞的凋亡率與氯胺酮的作用時間、濃度呈依賴關系。見表1。

表1 氯胺酮處理后小鼠皮質神經細胞的凋亡率

與30 mg/ml組相比:1)P<0.05，2)P<0.01

2.2 氯胺酮處理后小鼠皮質神經細胞LDH釋放率 未經氯胺酮處理的小鼠皮質神經細胞的LDH釋放率為100%，并且不隨作用時間的變化而變化。與對照組相比，氯胺酮作用后的神經細胞LDH釋放率升高，與氯胺酮作用時間呈正相關，6 h皮質神經細胞LDH釋放率為(115±5.27)%,18 h釋放率變化較大為(121±4.26)%，此時氯胺酮開始高效發揮其誘導細胞凋亡的作用，18 h LDH釋放率為(160±5.28)%；24 h LDH釋放率為(192±4.39)%。

2.3 Western印跡法檢測GSK-3β蛋白的表達 6 h組與對照組相比GSK-3β蛋白表達量升高，約為對照組的(105.4±4.13)%，12 h的GSK-3β蛋白表達量呈現較低水平為(118.7±3.56)%，18 h表達量明顯升高為(144.7±3.72)%，24 h為(197.3±4.36)%，加入氯胺酮處理皮質神經細胞6～24 h內，GSK-3β蛋白活性被激活。見圖1。

2.4 流式細胞儀檢測氯胺酮處理后皮質神經細胞的凋亡 與對照組未經氯胺酮處理的皮質神經細胞相比，處理后的皮質神經細胞出現了大量的凋亡，表明氯胺酮能夠誘導皮質神經細胞的凋亡。見圖2。

圖1 氯胺酮不同時間處理后GSK-3β蛋白表達

圖2 流式細胞儀檢測氯胺酮處理后皮質神經細胞的凋亡

3 討 論

氯胺酮是臨床上經常使用的全身麻醉劑，它能夠使交感神經保持正常的功能，對循環、呼吸系統也有一定的保護作用，其主要作用機制是通過抑制神經遞質的傳遞及其與NMDA受體作用，從而發揮全身麻醉的效果〔4〕。有研究表明大劑量使用氯胺酮能夠使小鼠神經細胞發生凋亡，嚴重影響后天的認知學習功能〔5〕。機體神經系統的發育過程中細胞的凋亡屬于維持機體平衡，但是神經系統的病變則會加速神經細胞的凋亡〔6〕。本研究選取了氯胺酮的4個濃度30、60、80、100 mg/ml，結果顯示氯胺酮對皮質神經細胞的誘導加速，細胞的凋亡率升高。氯胺酮的濃度為80 mg/ml時，細胞的染色體已經嚴重變形〔7〕，因此本實驗對出生1 w左右的大鼠加大了藥物濃度，結果表明在100 mg/ml氯胺酮小鼠皮質神經細胞的凋亡率高于80 mg/ml。高濃度的氯胺酮能夠嚴重影響小鼠大腦皮質神經細胞的凋亡。

LDH是機體糖酵解過程中的一種酶，廣泛存在于機體內參與正常的生理代謝，組織發生病變或者遭到破壞時細胞內的LDH滲出，導致細胞基質中LDH含量升高，因此LDH是檢測機體代謝的最敏感的指標〔8〕。本文結果顯示，氯胺酮處理后小鼠皮質神經細胞LDH釋放率升高，18 h氯胺酮開始高效發揮其誘導細胞凋亡的作用，24 h皮質神經細胞的LDH釋放率達到最大。

GSK-3β是廣泛分布在腦組織中的一類絲氨酸類蛋白激酶，參與神經傳遞過程中的信號傳遞〔9〕。研究表明GSK-3β蛋白參與神經細胞誘導凋亡，關于GSK-3β參與大腦皮質神經細胞誘導凋亡的報道較少，神經細胞受損后GSK-3β蛋白結構中的Ser9發生去磷酸化，GSK-3β被激活進而調節神經信號傳導中其他相關應答基因的表達〔10〕。倪錦〔11〕研究表明氯胺酮能夠誘導乳鼠皮質神經細胞凋亡主要是通過激活GSK-3β活性發揮作用〔11〕。本實驗發現，加入氯胺酮處理皮質神經細胞6～24 h，GSK-3β蛋白活性被激活。

高劑量氯胺酮能夠導致幼鼠腦細胞的凋亡，神經系統內細胞凋亡是機體維持正常生理活動的正常現象，但受損或病變的神經細胞則會出現異常凋亡，進而影響腦部神經的正常生理功能〔12〕。本研究中100 mg/ml氯胺酮作用小鼠腦皮質神經細胞24 h后流式細胞儀檢測，結果表明處理后的神經細胞出現大量凋亡，這一結果與之前測定的細胞凋亡率升高相符合，表明氯胺酮能夠誘導腦細胞大量凋亡。

綜上所述，本實驗證明高劑量氯胺酮能夠促使腦皮質神經細胞凋亡，并且激活GSK-3β活性，從而使腦部神經系統功能受損。

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10 Nelson CD，Kim MJ，Hsin H，etal.Phosphorylation of threonine-19 of PSD-95 by GSK-3β is required for PSD-95 mobilization and long-term depression〔J〕.J Neurosci，2013；33(29)：12122-35.

11 倪 錦.氯胺酮對乳鼠腦皮質神經細胞凋亡的影響，機制探討及參附注射液的防治〔D〕.廣州：南方醫科大學博士論文，2011.

12 Wei HJ,Xu JH,Li MH,etal.Hydrogen sulfide inhibits homocysteine-induced endoplasmic reticulum stress and neuronal apoptosis in rat hippocampus via upregulation of the BDNF-TrkB pathway〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2014；35(6)：707-15.

〔2015-11-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

肖 莉(1978-)，女，碩士，主治醫師，主要從事麻醉方面研究。

R285

A

1005-9202(2016)21-5264-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.022