Exendin4拮抗Aβ1-42所致大鼠識別記憶損傷的保護效應研究*

潘艷芳，賈曉濤，方 艷

（1.陜西中醫藥大學基礎醫學院病理教研室，陜西咸陽712046；2.西安市中心醫院神經內科，陜西710003）

·論 著·

Exendin4拮抗Aβ1-42所致大鼠識別記憶損傷的保護效應研究*

潘艷芳1，賈曉濤2，方 艷1

（1.陜西中醫藥大學基礎醫學院病理教研室，陜西咸陽712046；2.西安市中心醫院神經內科，陜西710003）

目的 探討Exendin4拮抗淀粉樣β蛋白（amyloid β-protein，Aβ）引起大鼠識別記憶功能傷害的保護作用。方法 將80只健康成年雄性SD大鼠隨機分為對照組（PBS組）、Aβ1-42組、不同劑量Exendin4組（0.02、0.20、2.00 nmol）、不同劑量Exendin4（0.02、0.20、2.00 nmol）聯合Aβ1-42組，每組10只。各組大鼠經側腦室給藥后進行新物體識別實驗，曠場中間隔5 h分別放置2種物體，每次大鼠自由探索10 min。檢測指標為新物體識別指數（NOI）=探索新物體時間/（探索新物體時間+探索舊物體時間）×100%。結果 Aβ1-42組大鼠NOI明顯低于對照組，0.20、2.00 nmol Exendin4聯合Aβ1-42組大鼠NOI明顯高于Aβ1-42組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 Exendin4預處理能劑量依賴性對抗Aβ1-42引起的大鼠識別記憶損傷。

淀粉樣β蛋白； 大鼠； 記憶； 動物實驗； Exendin4

淀粉樣β蛋白（amyloid β protein，Aβ）是阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）的病理變化基礎，Aβ只要形成聚集體就能表現出明顯的神經毒性[1-2]。然而，目前為止仍缺乏有效的治療AD的手段。近年來，有研究發現，Exendin4能減緩神經退行性疾病的發生，減輕相應臨床癥狀[3-4]。然而，迄今為止，尚未見關于Exendin4對AD大鼠發揮神經保護作用的行為學實驗研究，特別是關于對空間識別記憶能力的影響。因此，本研究通過新物體辨別實驗，比較不同劑量Exendin4處理組大鼠新物體識別指數（novel object index，NOI），探討Exendin4對Aβ1-42所致的空間工作能力損害的保護效應。

1 材料與方法

1.1 材料 Aβ1-42、Exendin4均購自Sigma（St.Louis，MO，USA）。

1.2 方法

1.2.1 Aβ1-42配制及老化處理 將1 mg粉末狀Aβ1-42溶于1 mL HFIP中，間斷振蕩1 h后充分溶解。然后按每管100 μL分裝保存于-80℃冰箱。使用前每管Aβ1-42加二甲基亞砜6μL，充分混懸后加DPBS 34 μL，37℃孵育72 h。

1.2.2 Exendin4的處理 將粉末狀Exendin4溶于PBS中，分裝后保存于-20℃冰箱。

1.2.3 實驗動物制備及分組 將成年雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（230~250 g）用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后固定于腦立體定位儀（68004，瑞沃德公司）。暴露顱骨，以前囟點為基準，用骨鉆于擬插入給藥導管部位鉆孔，將自制不銹鋼給藥導管插入麻醉大鼠側腦室（前囟點后0.8mm、中線旁開1.3mm），利用微量注射泵（KD Scientific，Inc，KDS 310 Plus，USA）和5 μL微量注射器行腦內注射給藥。各組動物注射藥物總體積為3 μL，給藥速度為0.5 μL/min，注射結束后留針5 min，藥物注射間隔15 min。將80只健康成年雄性SD大鼠隨機分為對照組（PBS組）、Aβ1-42組、不同劑量Exendin4組（0.02、0.20、2.00 nmol）、不同劑量Exendin4（0.02、0.20、2.00 nmol）聯合Aβ1-42組，每組10只。

1.2.4 新物體識別實驗 首先將2個形狀大小、顏色完全相同的物體置于曠場中央區，2個物體間相距25 cm，分別距離曠場宮體壁15 cm，然后將大鼠由非物體區域的中點貼壁放入，讓其自由探索10 min后取出大鼠，將曠場中1個物體換為材質相同、顏色和形狀不同的新物體，大鼠休息5 h后再從同一位置放入，讓其自由探索10 min，由頂部的紅外攝像頭記錄大鼠探究物體時間，實驗數據由 Ethovision3.0軟件系統（Noldus InformationTechnology，Wageningen，荷蘭）采集，計算NOI[5]=探索新物體時間/（探索新物體時間+探索舊物體時間）× 100%。實驗結束后用75%乙醇擦洗曠場以消除異味對下一只大鼠實驗結果的影響。

1.3 統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，采用two-way ANOVA。采用Sigmaplot10.0作圖。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Aβ1-42組、對照組大鼠NOI比較 Aβ1-42組大鼠NOI[（53.21±1.23）%]明顯低于對照組[（67.02±1.04）%]，差異有統計學意義（P<0.05），見圖1。

圖1 Aβ1-42組、對照組大鼠NOI比較

2.2 Aβ1-42組、不同劑量Exendin4聯合Aβ1-42組大鼠NOI比較 0.02、0.20、2.00 nmol Exendin4組大鼠NOI [分別為（69.01±0.97）、（69.36±1.21）、（70.25±1.03）]與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。0.02 nmol Exendin4聯合Aβ1-42組大鼠NOI[（53.62±1.06）%]與Aβ1-42組比較，差異無統計學意義（P>0.05），但0.20、2.00 nmol Exendin4聯合Aβ1-42組大鼠NOI[分別為（57.21±2.01）、（63.01±1.32）%]明顯高于Aβ1-42組，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖2。

圖2 Aβ1-42組、不同劑量Exendin4聯合Aβ1-42組大鼠NOI比較

3 討 論

寡聚體形式Aβ1-42是引起神經細胞毒性和導致AD發生、發展的關鍵因素[6]。因此，本研究應用經“老化”后的Aβ1-42進行側腦室注射，結果顯示，Aβ1-42損害了大鼠識別記憶功能；Exendin4預處理可劑量依賴性改善Aβ1-42引起的識別記憶損傷；該結果與Jia等[3]發現的Exendin4有效拮抗Aβ1-42所致的空間學習記憶傷害是一致的。2種行為學檢測方法從不同角度考察了Exendin4對AD大鼠的神經保護作用。

近年來，有研究發現，AD與2型糖尿病（type 2 diabetesmellitus，T2DM）具有相關性[7]。所以，有學者提出，利用控制T2DM的手段拮抗Aβ的神經毒性治療AD。已有研究表明，胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）可減輕Aβ1-42導致的海馬突觸可塑性損傷和空間學習記憶損傷[8-9]。GLP-1與腦內GLP-1受體結合后可抵制興奮毒性和氧化應激、調節細胞內鈣穩態，甚至減輕 AD患者腦內病理改變[10]。本研究應用的Exendin4較 GLP-1半衰期長且更易通過血腦屏障。Exendin4發揮神經保護作用的機制較復雜。已有研究證實，Aβ能抑制PI3K通路引發大鼠學習、記憶能力下降[9]；同時，Aβ可導致GSK3β過表達，從而使Aβ聚集、Tau蛋白磷酸化、細胞凋亡等[11-12]。而GLP-1受體激動劑通過興奮GLP-1受體激活PI3K，從而活化PDK和Akt，抑制 GSK3β發揮神經保護作用[13]。Exendin4能通過與GLP-1受體結合，激活腺苷酸環化酶催化腺苷三磷酸生成環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），提高細胞內cAMP水平，觸發鈣離子內流，增加神經遞質釋放，加快神經興奮性傳導，從而增強學習、記憶和認知能力[4]。提示Exendin4對Aβ可能具有強大的中樞拮抗效應。

盡管Aβ的神經毒性和Exendin4神經保護作用機制十分復雜，但Exendin4拮抗Aβ后的神經保護效應無論在細胞水平還是整體行為學表現上均是肯定的。提示Exendin4可能對AD，特別是伴T2DM的AD具有潛在的治療價值

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Study on protective effects of Exendin4 for antagonizing Aβ1-42-induced recognition memory impairment in rats*

Pan Yanfang1，Jia Xiaotao2，Fang Yan1
（1.Teaching and Researching Section of Pathology，School of Basic Medical Science，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi 712046，China；2.Department of Neurology，Xian Municipal Central Hospital，Xian，Shaanxi 710003，China）

Objective To investigated the protective action of Exendin4 for antagonizing recognition memory impairment induced by amyloid β-protein-42（Aβ1-42）in rats.Methods Eighty healthy adult male Wistar rats were randomly divided into the control group（PBS），Aβ1-42，group，different concentrations of Exendin4（0.02，0.20，2.00 nmol）groups and different concentrations of Exendin4（0.02，0.20，2.00 nmol）combined Aβ1-42 group，10 cases in each group.The rats in all groups were performed the new object recognition experiment after lateral cerebral ventricular medication injection.Two kinds of object were respectively placed in the open-field for interval of 5 h.The each time free exploration in rat lasted for 10 min.The detection index was the novel object recognition index（NOI）=exploring novel object time/（exploring novel objects time+exploring familiar objects time）×100%.Results The NOI percentage in the Aβ1-42 group was significantly lower than that in the control group（P<0.01）and the NOI percentage in the 0.20，2.00 nmol Exendin4 combined Aβ1-42 group was significantly higher than that in the Aβ1-42 group，the differences were statistically significant（P>0.05）.Conclusion Exendin4 pretreatment can dose-dependently antagonize against the Aβ1-42-induced recognition memory impairment in rats.

Amyloid beta-protein； Rats； Memory； Animal experimentation； Exendin4

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.22.001

A

1009-5519（2016）22-3421-02

2016-07-22）

陜西省自然科學基礎研究計劃項目（2015JQ8299）。

潘艷芳（1982-），博士研究生，講師，主要從事淀粉樣β蛋白毒性的產生機制及防治研究。