大黃甘草湯對重癥急性胰腺炎腸黏膜屏障功能的對照研究

陳小鵬，樊 勇，王躍斌，陳羅飛，王 琛

（蘭州大學第二醫院普外四科，甘肅蘭州730030）

大黃甘草湯對重癥急性胰腺炎腸黏膜屏障功能的對照研究

陳小鵬，樊 勇，王躍斌，陳羅飛，王 琛△

（蘭州大學第二醫院普外四科，甘肅蘭州730030）

目的 探討大黃甘草湯對重癥急性胰腺炎（SAP）腸黏膜屏障功能的影響。方法 將45只清潔級健康雄性SD大鼠采用隨機數字表法隨機分為大黃甘草湯治療組（D組）、SAP模型組（P組）和假手術組（S組），每組15只。采用逆行注射5%牛黃膽酸鈉（0.5 mL/100 g）制備大鼠SAP模型。D組給予大黃甘草湯（2.0 mL/100 g），P、S組給予0.9%氯化鈉溶液（2.0 mL/100 g）。分別于建模后12、24、36 h經腹主動脈采集血標本檢測血淀粉酶、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、IL-10、D-乳酸水平等。結果 D組大鼠血淀粉酶、TNF-α、IL-6、D-乳酸水平明顯低于P組，IL-10水平明顯高于P組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 大黃甘草湯對SAP大鼠腸黏膜屏障功能具有保護作用，治療SAP療效較好。

大黃甘草湯； 急性??； 胰腺炎； 腸黏膜

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種多因素誘發并累及多臟器的危重疾病，起病急、進展快，并發癥發生率達65%，病死率達34%～53%，全胰壞死率大于90%[1]。大量研究顯示，SAP容易發生腸黏膜屏障功能障礙[2]。腸黏膜屏障功能障礙是SAP并發感染甚至形成腹腔膿腫，誘發和加重全身炎癥反應綜合征、多器官功能障礙綜合征及病死率居高不下的關鍵所在[3-4]。因此，維護腸黏膜屏障功能的完整性，保持腸黏膜屏障功能對減弱全身炎性反應程度，延緩甚至阻止其向多器官功能衰竭轉化具有重要意義。大黃甘草湯具有溫陽止痛、通腑化瘀等功效，是中醫臨床治療SAP等急危重癥的常用方劑。本研究通過建立SAP大鼠模型，考察大黃甘草湯對SAP大鼠腸黏膜屏障功能的影響，旨在為防治SAP腸屏障損傷提供新的實驗依據及方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 由蘭州大學實驗動物中心提供的健康雄性Sprague Dawley（SD）清潔級大鼠45只，體質量280～300 g，平均（286±3）g。實驗開始前均適應性喂養7d。

1.1.2 藥物及試劑 大黃、甘草均購自北京同仁堂飲片有限責任公司，由蘭州大學第二醫院藥劑科煎制大黃甘草湯[大黃12 g、甘草3 g]；D-乳酸測定試劑盒和牛黃膽酸鈉（Sodium Taurocholate）購自Sigma公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-10酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海森雄科技實業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 將45只清潔級健康雄性SD大鼠采用隨機數字表法隨機分為大黃甘草湯治療組（D組）、SAP模型組（P組）和假手術組（S組），每組15只；又將各組大鼠分為12、24、36 h 3個亞組，每個亞組5只；大鼠于術前禁食、不禁飲12 h，用1%戊巴比妥鈉溶液（0.4 mL/100 g）進行腹腔內麻醉。將大鼠置于仰

臥位，四肢及頭固定于操作臺上，備皮后用聚維酮碘消毒，鋪無菌洞巾，于上腹正中做6 cm切口進入腹腔，暴露肝門，分離胰膽管，提起十二指腸以小號血管夾分別夾住十二指腸段和肝門部胰膽管。以0.75 mm動靜脈留置針穿刺胰膽管注射（最好用微泵注射）5%牛黃膽酸鈉（0.5 mL/100 g），持續1 min，停留5 min，然后拔除針頭，去除血管夾，可觀察到大鼠胰腺組織明顯水腫、出血，縫合腹壁各層。S組僅開腹后輕翻胰腺組織。各組大鼠術后均于背部皮下注射0.9%氯化鈉溶液（2.0 mL/ 100 g）以補充術中失液。D組大鼠術后清醒后給予大黃甘草湯2.0 mL/100 g灌胃，以后每6小時給藥1次；P、S組于相應時間點給予等量0.9%氯化鈉灌胃。三組大鼠造模后12、24、36 h各處死5只大鼠，下腔靜脈采血檢測血淀粉酶、D-乳酸及各細胞因子水平。

1.2.2 檢測指標 采用全自動生化分析儀測定血淀粉酶水平，采用ELISA法測定血清TNF-α、IL-6、IL-10水平，采用D-乳酸測定試劑盒測定D-乳酸水平。均按試劑盒說明書要求操作。

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 三組大鼠血淀粉酶水平比較 S組大鼠造模后12 h血淀粉酶稍升高，D、P組大鼠血淀粉酶水平明顯升高，D、P組大鼠血淀粉酶水平比較，差異無統計學意義（t=1.474，P＞0.05）；D、P組大鼠造模后48 h血淀粉酶水平仍處于高水平，但D、P組大鼠血淀粉酶水平比較，差異仍無統計學意義（t=1.254，P＞0.05）；三組大鼠造模后36 h血淀粉酶水平均下降，D組大鼠淀粉酶水平下降更為明顯，與P組大鼠淀粉酶水平比較，差異有統計學意義（t=3.719，P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠血淀粉酶水平比較（±s，U/L）

表1 三組大鼠血淀粉酶水平比較（±s，U/L）

注：與P組同時間點比較，t=3.719，aP＜0.05。

組別 12 h 24 h 36 h n D組P組S組15 15 15 5 471.60±368.96 5 453.70±454.16 1 212.08±247.51 5 511.03±423.17 5 404.81±345.25 978.35±118.06 4 920.19±308.51a5 322.97±369.06 905.04±145.55

2.2 三組大鼠各細胞因子、D-乳酸水平比較 三組大鼠造模后12、24 h D-乳酸及各細胞因子水平均呈升高趨勢，D組大鼠造模后12 h TNF-α水平就明顯低于P組，差異有統計學意義（t=2.622，P＜0.05），P、D組大鼠造模后24、36 h TNF-α水平均呈升高趨勢，P、D組大鼠TNF-α水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。P組大鼠造模后36 h IL-6水平仍持續升高，而D組大鼠IL-6水平則呈下降趨勢，P、D組大鼠IL-6水平比較，差異有統計學意義（t=2.228，P＜0.05）。D組大鼠造模后24 h IL-10水平升高幅度明顯大于P組，差異有統計學意義（t= 3.719，P＜0.05），且造模后36 h IL-10水平仍繼續升高，與P組大鼠IL-10水平比較，差異也有統計學意義（t=2.447，P＜0.05）。D組大鼠造模后12 h D-乳酸水平低于P組，但差異無統計學差異（t=1.254，P＞0.05），D組大鼠造模后36hD-乳酸水平明顯低于P組，差異有統計學意義（t= 4.791，P＜0.05），見表2。

表2 三組大鼠各細胞因子、D-乳酸水平比較（±s）

表2 三組大鼠各細胞因子、D-乳酸水平比較（±s）

注：與P組同時間點比較，t=2.622，aP＜0.05；t=2.228，bP＜0.05；t=3.719，cP＜0.05；t=2.447，dP＜0.05；t=4.791，eP＜0.05。

組別D組（n=15）12 h 24 h 36 h P組（n=15）12 h 24 h 36 h S組（n=15）12 h 24 h 36 h TNF-α（pg/mL）IL-6（pg/mL）IL-10（pg/mL）D-乳酸（μg/mL）207.21±46.28a235.25±45.87 278.66±54.11 598.75±51.11 678.84±59.41 581.51±49.58b85.86±9.52 177.93±16.14c222.52±14.32d64.23±5.75 76.63±9.44 86.39±6.49e232.59±53.13 261.34±51.39 308.96±63.35 607.25±49.02 717.11±40.02 805.77±48.68 88.86±14.44 159.78±16.59 193.42±15.98 67.26±5.17 82.01±7.02 106.28±10.45 22.38±6.51 22.39±4.66 21.48±7.79 153.70±15.25 183.50±11.52 236.70±24.21 21.61±2.71 34.68±6.76 35.42±4.55 16.48±4.47 19.13±3.66 15.38±4.55

3 討 論

SAP是普外科病死率最高的危重病癥之一，以胰腺實質出血、壞死為主要特征[4]，常并發心、肺、腎、消化道等多器官功能衰竭。消化道是SAP危及的靶器官之一，在發病早期階段即可出現腸黏膜結構損傷、腸壁功能障礙，進而使腸道細菌、內毒素進入體循環而發生腸源性內毒素血癥，誘發全身炎癥反應綜合征甚至多器官功能衰竭[5]。目前，SAP治療以西藥為主聯合中藥治療。中醫藥對SAP的治療方法及手段較多，治療的同時且對相關臟器具有一定保護作用。已有多種單味及中藥復方用于臨床SAP的治療[6-7]。

大黃甘草湯是古籍《金匱要略》中的經典名方。方中生大黃性味苦寒，有瀉實熱、蕩滌腸胃、祛瘀解毒之功，現代研究表明，大黃能松弛Oddis括約肌、避免膽汁淤積、消除膽源性胰腺炎的病因、清除氧自由基等，可誘導胰腺腺泡細胞凋亡，減輕胰腺水腫，促進胰腺細胞修復[8]；甘草性味甘平，能守中、解毒、緩和藥性。二藥相伍，瀉中有補，通中寓守，相輔相成。有研究顯示，大黃甘草湯能減輕胰腺損傷及機體炎性反應[9-10]。

本研究采用逆行注射5%牛黃膽酸鈉（0.5 mL/100g）制備大鼠SAP模型，通過大黃甘草湯對SAP大鼠進行干預，檢測各組大鼠不同時間點血淀粉酶、炎性細胞因子（TNF-α、IL-6、IL-10）、D-乳酸水平。在3個時間點上，P、D組大鼠造模后12、24、36 h血淀粉酶水平均明顯高于S組，D組大鼠造模后36 h血淀粉酶水平開始降低，

造模后36 h血淀粉酶水平明顯低于P組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

目前認為，促炎性細胞因子在SAP及后續的全身炎性反應中發揮了重要作用[10]，其中TNF-α是SAP中最早升高的炎性細胞因子，TNF-α由巨噬細胞產生，調節中性粒細胞，上調黏附分子對上皮細胞的作用，引導毛細血管滲透及組織損害，胰腺炎時TNF-α還可產生很多重要的促炎性細胞因子，如IL-6等，這些促炎性細胞因子的變化可直接反映并預測胰腺炎的炎癥嚴重程度。IL-10是由巨噬細胞、樹突狀細胞和T淋巴細胞釋放的一種重要的抗炎性細胞因子，能抑制巨噬細胞和樹突狀細胞活化，從而抑制其分泌細胞因子的能力和降低輔助其他細胞的能力，限制炎性反應的發展。有研究發現，IL-10通過控制TNF-α生成而對胰腺局部及全身炎性反應具有抑制作用，血清IL-10水平也能反映急性胰腺炎的炎性反應程度，且是一個早期預測急性胰腺炎預后的良好指標[11]。

本研究結果顯示，P、D組大鼠造模后24 h TNF-α、IL-6水平均高于S組，且P、D組大鼠TNF-α、IL-6水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），但P組大鼠造模后36hTNF-α、IL-6水平仍持續升高，而D組大鼠TNF-α、IL-6水平則開始大幅度下降。P、D組大鼠造模后24 h IL-10水平均高于S組，且D組大鼠造模后24、36 h IL-10水平均高于P組，差異均有統計學意義（P<0.05），說明大黃甘草湯可明顯緩解SAP誘發的胰腺局部及機體全身炎癥，有利于大鼠腸道屏障功能的恢復。

D-乳酸是胃腸道多種細菌代謝后產生的不易被腸道吸收的共同物質，但在應激等特殊情況時腸黏膜屏障會受損，腸道通透性增加，腸道D-乳酸生成增加并進入血液并在血液中蓄積而導致D-乳酸水平升高。因此，D-乳酸水平可被作為標記物反映腸缺血性損傷及腸道屏障功能損傷。本研究結果顯示，D、P組大鼠造模后各時間點D-乳酸水平均高于S組，D組大鼠造模后36 h D乳酸水平明顯低于P組，差異有統計學意義（P＜0.05），說明大黃甘草湯可明顯減輕SAP腸道炎性反應，促進腸道屏障功能的快速恢復。

綜上所述，大黃甘草湯對大鼠SAP誘發的腸黏膜屏障功能障礙具有明顯改善作用，有利于腸黏膜屏障功能的早期恢復，對疾病的轉歸及預后的改善具有積極意義。本研究雖然遵循嚴格的操作程序標準，但仍無法避免人為因素造成的實驗差異，如模型制備時牛黃膽酸鈉的滴注濃度，注藥時的操作手法是否對大鼠造成了人為傷害等。同時，本研究觀察時間較短、樣本量偏少等原因或多或少可能影響到本研究結論的準確性，因此，尚需進行后續更深入的研究以進一步探討。

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Contrastive study of Dahuanggancao Decoction on intestinal mucosal barrier function in severe acute pancreatitis

Chen Xiaopeng，Fan Yong，Wang Yuebin，Chen Luofei，Wang Chen△
（Forth Department of General Surgery，Second Hospital，Lanzhou University，Lanzhou，Gansu 730030，China）

Objective To explore the effect of Dahuanggancao Decoction on the intestinal mucosal barrier function of severe acute pancreatitis（SAP）.Methods Forty-five clean class SD healthy male rats were randomly divided into the Dahuanggancao Decoction group（D，n=15），SAP model group（P，n=15）and sham operation group（S，n=15）.The SAP rat model was induced by the retrograde injection of 5%sodium taurocholate（0.5 mL/100 g）.The group D was given Dahuanggancao Decoction（2.0 m/100 g），while the group P and S was given 0.9%sodium chloride solution（2.0 mL/100 g）.The blood samples were collected from inferior vena cava at 12，24，36 h after model construction and serum amylase，TNF-α，IL-6，IL-10 and D-lactic acid levels were detected. Results The serum amylase，TNF-α，IL-6 and D-lactic acid levels in the group D were significantly lower than those in the group P，while the IL-10 level was significantly higher than that in the group P，the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion Dahuanggancao Decoction has a protective effect on the intestinal mucosal barrier function of SAP rats and has good effect in treating SAP.

Dahuang gancao decoction； Acute disease； Pancreatitis； Intestinal mucosa

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.22.005

A

1009-5519（2016）22-3432-03

2016-07-09）

陳小鵬（1990-），碩士研究生，主要從事膽胰外科的臨床研究。

△通訊作者，E-mail：wedfjack@163.com。