依那西普對博萊霉素所致小鼠肺纖維化的影響及其機制

陳 忱 賈曉民 趙 杰

(徐州醫學院第二附屬醫院呼吸科，徐州221002)

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依那西普對博萊霉素所致小鼠肺纖維化的影響及其機制

陳 忱 賈曉民①趙 杰

(徐州醫學院第二附屬醫院呼吸科，徐州221002)

目的：觀察依那西普對博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化的作用及可能機制。方法：方法將30只SPF級雄性昆明小鼠隨機分為3組，即對照組、模型組、干預組，每組10只。對照組小鼠氣管內灌注生理鹽水，模型組小鼠氣管內灌注博萊霉素5 mg/kg，干預組小鼠氣管內灌注博萊霉素后，3 mg/kg依那西普腹腔注射，一周2次。于造模后28 d處死小鼠，收集肺組織，堿水解法檢測羥脯氨酸含量；肺組織用4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋切片，行HE染色及Masson染色；Western blot法檢測肺組織NF-κB和磷酸化NF-κB的表達。結果：干預組小鼠肺組織羥脯氨酸含量較模型組明顯下降(P<0.01)；干預組肺組織炎癥評分較模型組明顯下降(P<0.01)，肺纖維化評分較模型組下降(P<0.01)；干預組肺組織磷酸化NF-κB的表達下降(P<0.01)。結論：依那西普可抑制NF-κB的磷酸化，減輕博萊霉素導致的小鼠肺部炎癥程度和纖維化改變，延緩肺纖維化進展。

肺纖維化；博萊霉素；依那西普；腫瘤壞死因子α；NF-κB

肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是一種漸進性發展的疾病，目前其發病機制尚不明確，尚無明確有效的治療措施[1]。腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)能促進成纖維細胞增殖和細胞外基質沉積，促進纖維化的形成，核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)可以參與TNF-α介導的炎癥反應和上皮-間質轉化過程[2]。本實驗用博萊霉素(Bleomycin,BLM)建立小鼠肺纖維化模型，用依那西普(Etanercept,Et)與TNF-α受體結合，探討依那西普對肺纖維化的干預作用及其對NF-κB的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 8～10周齡SPF級雄性昆明小鼠30只，體重為18～22 g，購自徐州醫學院動物中心。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 將30只小鼠隨機分為3組，即對照組、模型組、干預組，每組10只。小鼠用10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉，固定于操作臺上，消毒，沿頸部正中切開，鈍性分離至暴露氣管，模型組及干預組給予博萊霉素(5 mg/kg)氣管內注入，對照組注入等量生理鹽水。模型建立后干預組小鼠給予依那西普3 mg/kg溶于生理鹽水內腹腔注射，一周2次，對照組及模型組給予等量生理鹽水腹腔注射。于造模后第28天腹主動脈放血法處死小鼠，收集肺組織標本待測。

1.2.2 觀察指標 ①肺組織羥脯氨酸含量測定：精確稱量30 mg肺組織，加入裂解液1 ml混勻，95℃水解20 min，流水冷卻后各管加指示劑1滴，加入調pH甲液1 ml，逐滴加入調pH乙液至液體變為黃綠色，加雙蒸水至10 ml，加入適量活性炭，3 500 r/min離心10 min，取上清液1 ml作檢測；②肺組織病理學表現及肺泡炎和纖維化評分：取小鼠左肺于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片，行HE及Masson染色，參照Szapiel等[3]和Ashcroft等[4]的標準，對肺組織病理切片進行肺泡炎癥和纖維化程度進行評分。肺泡炎分為4級：0級：無肺泡炎；1級：輕度肺泡炎，面積小于全肺的20%；2級：中度肺泡炎，受累面積占20%～50%；3級：重度肺泡炎，受累面積大于50%。肺纖維化分級標準：0級：無纖維化；1級：輕度纖維化，受累面積小于全肺20%；2級：中度纖維化，受累面積占20%～50%；3級：重度纖維化，受累面積大于50%，肺泡結構紊亂。分別以0、1、2、3分代表0～3級評分。③Western blot法檢測肺組織NF-κB的表達：肺組織勻漿后提取總蛋白，測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳、轉膜，封閉液室溫封閉2 h。加入抗磷酸化NF-κB和NF-κB抗體，4℃孵育過夜，Washing Buffer洗膜3次，每次10 min；加入HRP標記的二抗室溫孵育2 h，Washing Buffer洗膜3次，每次10 min。將洗好的PVDF膜放入DCIP/NBT顯色液中避光顯色，應用Image-J軟件進行圖像分析處理。

1.2.3 藥物與材料 鹽酸博萊霉素(15 mg/支，日本化藥株式會社)。依那西普(25 mg/支，美國恩利公司)。Masson三色染色試劑盒、羥脯氨酸檢測試劑盒(南京建成生物工程有限公司)。NF-κB和P-NF-κB抗體、β-actin山羊抗鼠單克隆抗體(美國Bioworld公司)。

2 結果

2.1 小鼠肺組織羥脯氨酸含量 模型組小鼠肺組織羥脯氨酸的含量最高，為(125.61±5.65)μg/mg，對照組最低，為(34.96±2.88)μg/mg，干預組為(66.26±3.24)μg/mg。干預組羥脯氨酸含量明顯低于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)；模型組含量高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 小鼠肺組織病理學表現及肺泡炎和纖維化評分HE和Masson染色觀察：第28天時，對照組小鼠肺組織外觀大致正常，鏡下見肺組織肺泡結構完整，未見明顯炎癥細胞浸潤和膠原纖維沉積；模型組可見肺組織結構紊亂，肺泡內可見炎癥細胞浸潤，成纖維細胞大量增生，肺泡間隔增厚，肺組織內可見斑片狀藍色膠原纖維沉積；干預組肺組織結構尚完整，部分肺泡腔變形，肺泡間隔有所增厚，肺纖維化程度明顯好轉，未見片狀膠原纖維沉積，見圖1和圖2。

干預組小鼠炎癥和纖維化評分較模型組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)，模型組明顯高于對照組(P<0.01)，差異均有統計學意義，見表1。

2.3 依那西普對NF-κB和P-NF-κB蛋白表達變化 模型組小鼠肺組織內P-NF-κB蛋白表達明顯高于對照組(P<0.01)，經依那西普干預后，P-NF-κB的水平較模型組明顯降低(P<0.01)，見圖3。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色(×400)Fig.1 HE staining of lung tissue in mice(×400)Note: A.Control group;B.Model group;C.Intervention group.

圖2 各組小鼠肺組織Masson染色(×400)Fig.2 Masson staining of lung tissue in mice(×400)Note: A.Control group;B.Model group;C.Intervention group.

GroupInflammationscoreFibrosisscoreControlgroup00Modelgroup2.50±0.321)2.82±0.151)Interventiongroup1.36±0.191)2)1.25±0.131)2)

Note：Compared with control group,1)P<0.01；compared with model group,2)P<0.01.

圖3 Western blot檢測各組P-NF-κB的表達Fig.3 Expression of P-NF-κB in each group by Weste-rn blot

3 討論

肺纖維化病死率高，預后差，缺乏有效的治療措施，早期診斷和治療是阻斷疾病進展的關鍵。TNF-α為促炎細胞因子，參與炎癥反應的急性期，激活內皮細胞黏附，刺激成纖維細胞增殖，導致不可逆轉的組織損傷，在組織重構中發揮作用[5]。研究表明，博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化，TNF-α表達明顯升高，誘導其他細胞因子的分泌，如IL-1、IL-2、IL-6、TGF-β等，導致肺纖維化形成[6]。TNF-α可以促進纖維母細胞的增殖分化，通過TGF-β誘導的途徑促進膠原生成，觸發肺纖維化的產生[7]。本實驗應用依那西普競爭性阻斷TNF-α與其受體結合，發現干預組小鼠肺組織內代表膠原纖維代謝產物的羥脯氨酸含量明顯降低，病理組織切片觀察發現，與博萊霉素組相比，依那西普使小鼠肺部炎癥程度和纖維化改變明顯減輕，膠原沉積顯著減少，提示依那西普能抑制博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化。

NF-κB是一個重要的轉錄因子，可以調節許多炎癥細胞因子的表達，與炎癥性疾病的病理過程有密切關系。研究表明，TNF-α可以促進NF-κB的活化，同時受NF-κB的調控，導致炎癥性細胞因子生成增加，從而引起病理性的損傷[8]。博萊霉素誘導的肺纖維化，肺組織的NF-κB表達增加，也可引起TNF-α mRNA表達升高，經NF-κB反義寡核苷酸干預后，可以減低NF-κB的活性，從而減輕炎癥反應引起的組織損傷和纖維化程度[9]。據此推測，NF-κB的活化及其導致的細胞因子網絡的失衡，可能在肺纖維化動物模型的早期肺損傷過程中起關鍵作用，抑制NF-κB的活化，或許可以減輕博菜霉素導致的急性肺損傷，延緩肺纖維化的進程。本實驗結果證實，博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化，NF-κB蛋白磷酸化激活，經依那西普干預后P-NF-κB蛋白表達明顯下降，抑制NF-κB的產生和激活，因此，推測依那西普延緩肺纖維化過程與抑制NF-κB信號轉導通路有關。

依那西普可以減輕博萊霉素導致的小鼠肺出血、肺泡炎癥程度、肺泡萎縮和肺間質膠原沉積等病理過程，抑制并延緩肺纖維化的進展。其機制可能與抑制NF-κB磷酸化，從而減輕炎癥反應，抑制成纖維細胞增生有關。

[1] Raghu G,Collard HR,Egan JJ,etal.An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement:idiopathic pulmonary fibrosis:evidence-based guidelines for diagnosis and management[J].Am J Respir Crit Care Med,2011,183(6):788-824.

[2] 衛張蕊，周國鋒，田 瓊.炎癥細胞和細胞因子在肺纖維化中作用的研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志,2005,21(Suppl):S85-S87.

[3] Szapiel SV,Elson NA,Fulmer JD,etal.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude,athymic mouse[J].Am J Rev Respir Dis,1979,120(4):893-899.

[4] Ashcroft T,Simpson JM,Timbrell V,etal.Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale[J].J Clin pathol,1988,41(4):467-470.

[5] Oikonomou N,Harokopos V,Zalevsky J,etal.Soluble TNF mediates the transition from pulmonary inflammation to fibrosis[J].PLoS One,2006,1(1):e108.

[6] Kuroki M,Noguchi Y,Shimono M,etal.Repression of bleomycin-induced pneumopathy TNF[J].J Immunol,2003,170(1):567-574.

[7] 張 曉，林 莉，張光峰.腫瘤壞死因子及轉化生長因子在肺間質病變發病機制中的作用[J].中華風濕病學雜志,2010,14(1):13-16.

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[9] Inayama M,Nishioka Y,Azuma M,etal.A novel IkappaB kinase-beta inhibitor ameliorastes bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice[J].Am J Respir Crit Care Med,2006,173(9):1016-1022.

[收稿2015-07-25 修回2015-08-21]

(編輯 許四平)

Effect and mechanism of etanercept on pulmonary fibrosis in mice induced by bleomycin

CHEN Chen,JIA Xiao-Min,ZHAO Jie.Department of Respiratory Disease，the Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002,China

Objective:To observe the effect of etanercept on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice and its possible mechanisms.Methods: Thirty male SPF Kun ming mice were randomly assigned to control group(intratracheal saline injection)or model group(intratracheal injection of bleomycin 5 mg/kg)or intervention group(intratracheal bleomycin injection followed by etanercept 3 mg/kg intraperitoneal administration twice a week)(n=10 group).Lung tissue were taken after the sacrifice of the mice with 28 days of molding.The content of hydroxyproline of the right lung samples was measured by alkaline hydrolysis method,while the left lungs were fixed in 4% paraformaldehyde and embedded in paraffin with the sections stained with hematoxylin-eosin or Masson′s trichrome for pathological examination．Total tissue protein was extracted from lung homogenates to detect the expression of NF-κB and phosphorylation of NF-κB(P-NF-κB) by Western blot.Results: The content of hydroxyproline in lung tissue of mice of intervention arm was decreased significantly compared with the model arm(P<0.01).The alveolar structure of the intervention arm maintained integrity with alveolar septum slightly thickened.The inflammation and fibrosis scores were decreased significantly with noticeable greater improvement of pulmonary fibrosis than the model arm(P<0.01).In addition,the protein phosphorylation of NF-κB in the lung tissues was remarkably decreased in the intervention arm(P<0.01).Conclusion: Etanercept can inhibit the phosphorylation of NF-κB and reduce lung inflammation and fibrosis caused by bleomycin in mice,which may be useful in the treatment of pulmonary fibrosis.

Pulmonary fibrosis;Bleomycin；Etanercept;Tumor necrosis factor-α;NF-κB

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.007

陳 忱(1989年-)，女，碩士，主要從事肺間質方面研究，E-mail:354016903@qq.com。

R563.1

A

1000-484X(2016)04-0483-03

①通訊作者，E-mail:18305206090@163.com。