冰砂糖壽組培快繁研究

牟豪杰， 王 燕， 呂永平， 汪一婷， 李海營

(浙江省農業科學院病毒學與生物技術研究所，浙江杭州 310021)

?

冰砂糖壽組培快繁研究

牟豪杰， 王 燕， 呂永平， 汪一婷， 李海營*

(浙江省農業科學院病毒學與生物技術研究所，浙江杭州 310021)

[目的] 探討冰砂糖壽組培快繁的最佳條件。[方法]以冰砂糖壽幼嫩花序為外植體，研究冰砂糖壽組培快繁技術。[結果] 于MS + 5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7g/L瓊脂 的誘導培養基上成功誘導出愈傷組織，在分化培養基MS+0.3 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂上繼代培養可分化成不定芽，將不定芽轉接到增殖培養基MS + 0.3 mg/L 6-BA + 0.1 mg/LNAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂上增殖速度較快，增殖系數達3.79。將其移栽至營養基質(混合泥炭∶粗砂=1∶1)中，移栽成活率可達95%。[結論]建立了冰砂糖壽花序再生及快繁體系，為其規模化生產提供理論依據。

冰砂糖壽；愈傷組織；不定芽

冰砂糖壽(Haworthiakegazato)為百合科(Liliaceae)瓦葦屬(Haworthia)植物，該屬植物根據植株葉的形態，分為硬葉和軟葉2類。硬葉類植物葉面常被白色斑點，或結節成條狀，具有極高的觀賞價值。冰砂糖壽屬于硬葉類植株，其葉片小巧，表面布滿白色小刺如冰晶狀，是極其珍貴的多肉植物品種之一。但由于其繁殖率很低，傳統的繁殖大多采用分株、葉插和種子繁殖，不易成活且生長緩慢，同時，冰沙糖壽是雜合體，其有性雜交與母本差異較大，而植物組織培養繁殖速度快、繁殖系數大，繁殖后代整齊一致,能保持原有品種的優良性狀。 21 世紀初，與冰砂糖壽同屬的康平壽[1]、截形十二卷[2]、克里克特壽[3]、西山壽[4]、Haworthiamirabilis[5]和美吉壽[6]等多肉植物均有組織培養成功的報道，但未見其應用于產業化生產。筆者以冰砂糖壽幼嫩花序為外植體，研究其組織培養及快繁技術，以期為其規模化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試材料為冰砂糖壽(Haworthiakegazato)幼嫩花序。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒。選取冰砂糖壽幼嫩花序為外植體，去除閉合花蕾的外苞片，再將花蕾連同花柄逐個切下。外植體先用濃洗衣粉溶液浸泡1 h后再用自來水沖洗干凈，然后在70%乙醇溶液和有效氯濃度1% 的次氯酸鈉溶液中分別浸泡40 s和6 min，最后用無菌水沖洗3～5遍，每遍2 min。

1.2.2 愈傷組織的誘導與增殖。將消毒后的花蕾在無菌條件下先用解剖刀將其基部切傷后接種于愈傷組織誘導培養基(MS + 5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂)中，并使傷口接觸到培養基。于(23±2)℃暗培養42 d后轉于光照條件(光照時間16 h/d, 光照強度約為60 μmol/(m2·s)下培養。

1.2.3 愈傷組織的分化。將誘導出致密、球狀、淡黃色的愈傷組織暗培養14 d后，挑取生長量較大、色澤鮮亮、質地較硬的愈傷組織，接種在附加不同濃度分裂素及配比的培養基中，6-BA濃度分別為 0.1、 0. 3、 0.5 mg/L，進行單因素試驗，在光照時間16 h/d、光照強度60 μmol/(m2·s)、溫度(23±2)℃ 條件下培養。28 d后統計不定芽分化情況，每次試驗接種至少20 塊愈傷組織，重復3 次。

將誘導出的不定芽叢分成小叢接種在附加生長素和細胞分裂素的不同濃度及配比的培養基中，6-BA濃度分別為 0.1、0.3、0.5 mg/L，NAA濃度分別為 0、0. 1、0.3 mg/L，進行雙因素試驗，統計不定芽的分化情況。

1.2.4 壯苗與移栽。將增殖培養基上具有典型母本形態的叢生芽在無菌條件下切割成單株后轉接至壯苗培養基(1/2MS+30 g/L 蔗糖+7 g/L瓊脂)中，待植株達1.5～2.0 cm且出現明顯成株形態時即可切除其根部并清洗，然后置于通風避光處3～10 d晾至微皺縮后, 種于裝有基質6 cm×6 cm 營養缽基質(混合泥炭：粗沙=1∶1)中。種植完成后移入溫室內的小塑料拱蓬中保濕，同時用 0.5 g/L多菌靈處理。14 d后適當通風，注意及時噴水，保持基質濕潤；21 d后逐漸增大通風量。 夏季移栽時，移栽后前28 d應適當遮陰[7]。

2 結果與分析

2.1 不同濃度6-BA對愈傷組織分化的影響 幼嫩花蕾培養28～35 d后子房基部顯著膨大且組織逐漸玻璃化；培養42～49 d后先形成淡黃色愈傷組織(圖1 A)。將暗培養14 d后致密、球狀、淡黃色的冰砂糖壽愈傷組織置于添加不同濃度6-BA 的MS培養基中，約 21 d后出現深綠色小突起(圖1 B)，而后開始不定芽的分化(圖1 C)，接種35～42 d后分化出叢生芽(圖1 D)。隨著 6-BA 濃度的升高成芽率逐漸升高，當6—BA濃度達0.5 mg/L時，雖然不定芽誘導率達到最高(78.7%±15.9%)，但產生的叢生芽過于稠密，葉片小，植株生長不明顯且愈傷組織褐化嚴重，不適合進一步增殖；而當6-BA濃度達0.3 mg/L時，產生的叢生芽葉片較大，生長健壯(圖1E)。因此， MS+0.3 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂培養基最有利于芽的分化(表 1)。

圖1 冰砂糖壽的組培再生體系Fig.1 tissue culture regeneration system of Haworthia kegazato

Table 1 Effects of different 6 - BA concentration on callus differentiation

處理Treatment6-BA濃度6-BAconcent-ration∥mg/L愈傷組織接種數Numberofcallusvacci-nation∥個不定芽數Numberofadventitiousbud∥個誘導率Inductionrate∥%①0.1653046.9±9.1②0.3614574.1±14.5③0.5635078.7±15.9

2.2 不同濃度激素對不定芽增殖的影響 由表 2 可知，隨著 6-BA 濃度的升高增殖系數呈上升趨勢，而當 6-BA濃度達 0.5 mg/L 時，苗纖細過密，葉片小而薄，不利于產業化生產。從種苗產業化角度考慮，最適合冰砂糖壽不定芽增殖的培養基是MS + 0.3 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，其增殖系數可達3.79。

2.3 移栽成活率 不定芽在壯苗培養基(1/2MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂)上培養至植株達1.5～2.0 cm且出現明顯成株形態時，在營養基質(混合泥炭∶粗沙=1∶1)中移栽，其移栽成活率可達95%。

表2 不同濃度激素對不定芽增殖的影響

注：+.苗纖細，葉片小而薄； ++.苗纖細，葉片較小； +++.苗粗壯，葉片較厚； ++++.苗粗壯，葉片肥厚。

Note:+ stands for stender,smal and thin leaf;++ stands for slender plants and small leaf;+++ stands for granular plants and thick leaf;++++ stands for granular plants and thicker leaf.

3 結論

該試驗中，冰砂糖壽花序接種于MS + 5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的誘導培養基上42～49 d成功誘導出愈傷組織；暗培養14 d后的致密、球狀、淡黃色的愈傷組織在分化培養基( MS+0.3 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂)上35～42 d繼代可分化成不定芽叢，分化芽在MS + 0.3 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂培養基上增殖速度最快，叢生芽生長健壯，增殖系數達3.79。將其移栽在營養基質(混合泥炭∶粗沙=1∶1)中，其移栽成活率可達95%。

[1] 孫濤，金蕊，李德森. 康平壽的組織培養與快速繁殖[J]. 植物生理學報，2003, 39(3):232.

[2] 孫濤，李德森. 截形十二卷的組織培養與快速繁殖[J]. 植物生理學報，2002, 38(6):586.

[3] 左志宇，李建希，安曉云，等. 克里克特壽的組織培養與快速繁殖[J]. 植物生理學報，2007,43(2):311-312.

[4] 宋曉濤，沈萌，左志宇，等. 十二卷屬植物西山壽的組織培養與快速繁殖[J]. 植物生理學報，2007,43(5):883-884.

[5] PANDEY K N,SABHARWAL P S,CALKINS.Effects of ionizing radiation (60Co gamma rays) on growth and morphogenesis ofHaworthiamirabilis,haw. Callus tissue[J]. In vitro, 1979, 15(4):246-251.[6] 王泉，左志宇，宋曉濤，等. 百合科多肉植物美吉壽的組織培養與快速繁殖[J]. 植物生理學報，2008, 44(1):123-124.

[7] 牟豪杰，徐剛，汪一婷，等. 多漿植物組培苗移栽技術初探[J]. 浙江農業科學, 2005(6):450-451.

[8] 杜澤湘. 石榴新品種“九州紅”組織培養及快繁技術研究[J]. 安徽農業科學, 2013,41(9):3770-3771.

Tissue Culture and Rapid Propagation ofHaworthiakegazato

MOU Hao-jie, WANG Yan，LV Yong-ping, LI Hai-ying*

(Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Institute of Virology and Biotechnology, Hangzhou, Zhejiang 310021)

[Objective]The aim was to study tissue culture and rapid propagation ofHaworthiakegazato.[Method]With young inflorescence ofHaworthiakegazatoas explant, tissue culture and rapid propagation ofHaworthiakegazatowas studied. [Result] Embryogenic callus was initiated fromHaworthiacomptoniana×H.correctacv.'Aboukyuuinflorescencecultured on MS medium supplemented with 5 mg/L 6-BA, 0.5 mg/L IBA, 30g/L sucrose, and 7g/L agar. Subculture of these embryogenic calli on the MS + 0.3 mg/L 6-BA+ 30 g/L sucrose+7 g/L agar medium resulted in shoots and micropropagation of shoots on the MS + 0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA +30 g/L sucrose7 g/L agar medium with muitiplication coefficient of 3.79.The transplanting survival rate was 95% in nutritional substrates.[Conclusion] A subsequent plant regeneration from inflorescence callus ofHaworthiakegazatowere established, to provide theoretical basis for large-scale production.

Haworthiakegazato;Callus;Shoots

牟豪杰(1977- )男，浙江杭州人，助理研究員，從事花卉組培產業化研究。*通訊作者，助理研究員，碩士，從事生物技術方面的研究。

2016-09-14

S 682.33

A

0517-6611(2016)32-0140-02