MiR200對腎癌細胞增殖的影響分析

施瑩，林玲，闞佳音，劉海燕，馬增偉，李雙宇

1.齊齊哈爾醫學院第三附屬醫院腎內科，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫學院病理學院微形態實驗中心，黑龍江齊齊哈爾 161000

MiR200對腎癌細胞增殖的影響分析

施瑩1，林玲1，闞佳音1，劉海燕2，馬增偉1，李雙宇1

1.齊齊哈爾醫學院第三附屬醫院腎內科，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫學院病理學院微形態實驗中心，黑龍江齊齊哈爾 161000

目的 研究MiR200對腎癌細胞增殖的影響。 方法 整群選取2013年1月—2015年1月于齊齊哈爾醫學院第三附屬醫院就診的51例腎癌患者病理細胞和正常癌旁組織細胞，以及構建裸鼠腎癌模型，測量MiR-200在不同細胞中的表達量和腫瘤增殖情況。 結果MiR-200在裸鼠的SN12-PM6和人的786-o、A498表達中均低于正常組織的表達（P＜0.05），在48 h后能夠抑制腎癌細胞增殖（P＜0.05），48～72 h抑制情況最為顯著（P＜0.05）。 結論 MiR-200在腫瘤細胞中呈低表達水平，能夠抑制腎癌細胞增殖并能夠抑制裸鼠腎癌細胞生長。

MiR200；腎癌細胞；增殖

臨床上發現腎癌的患病例數逐年增加，而通常腎癌晚期已經失去了最佳手術機會，放療和化療成為了治療腎癌的主要手段[1]。研究發現[2-3]，MiRNAs在腫瘤發生過程中具有重要作用，可能會影響腫瘤細胞增殖，該研究以2013年1月—2015年1月于齊齊哈爾醫學院第三附屬醫院就診的51例腎癌患者和BALB/C裸鼠為研究對象，旨在研究MiR200對腫瘤細胞增殖的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究經院倫理委員會批準并取得患者知情同意。整群選取2013年1月—2015年1月該齊齊哈爾醫學院第三附屬醫院腎癌住院患者51人病理資料，其中男28人，女23人，年齡43～78歲，平均（62.63±4.89）歲。所有患者均經病理學檢查確診為腎癌[4]，未合并糖尿病等其他臟器功能障礙。實驗用20只BALB/C裸鼠購自北京市疾病預防控制中心，4～5周，16～18 g，隨機分為兩組，每組各10只，分別為MiR-Ctr組和MiR-200組，均按照SOF級環境飼養并按照動物建模手術操作原則進行操作。鼠源腎癌細胞株SN12-PM6，人源腎癌細胞株A498和786-o購自北京協和醫學院基礎醫學院細胞中心。用MTT法檢測MiR-200對腎癌細胞的增殖抑制率。

1.2 裸鼠建模及腎癌腫瘤細胞生長檢測

裸鼠腎SN12-PM6細胞，培養至對數生長期，消化離心PBS重懸，冰上保存。裸鼠腹腔注射1%水合氯醛溶液麻醉，將已備好的細胞懸液20 μL植于鼠左側腎臟實質內，縫合皮膚，置于SPF下飼養。隔日觀察裸鼠體重，第5周時用影像學方法檢測腫瘤細胞生長情況。第6周末處死裸鼠，解剖取其雙腎，稱量雙腎后用4%多聚甲醛溶液固定，制作石蠟、切片并進行HE染色及免疫組化反應

1.3 MiR200的表達量檢測

選取融合度達到90%以上并處于對數生長期的細胞，PBS沖洗后，Trizol法提取總RNA.提取的RNA經RT master mix法逆轉錄成cDNA,進行定量PCR擴增以U6為參照，取癌旁組織平均值，使用2-△△Ct計算腎癌細胞中MiR-200的表達倍數。選取處于對數生長期的細胞，Trizol法提取總RNA.提取的RNA經RT master mix法逆轉錄成cDNA,進行定量PCR擴增以U6為參照，取癌旁組織平均值，使用2-△△Ct計算腎癌細胞中MiR-200的表達倍數。

1.4 統計方法

數據運用SPSS 17.0統計學軟件進行錄入、分析。計量資料采用（）表示，多組間比較采用方差分析檢驗，計數資料采用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎癌細胞株中MiR-200的表達

以人正常組織平均值為對照，MiR-200在腎癌細胞中表達值顯著降低，各細胞培養組間與對照組均有差異，差異有統計學意義。見表1。

表1 兩組細胞侵襲能力比較()

表1 兩組細胞侵襲能力比較()

細胞株平均表達量F P Normal（n=51）SN12-PM6（n=20）786-o（n=51）A498（n=51）1.014±0.005 0.027±0.003 0.041±0.011 0.062±0.009 14.872 ＜0.001

2.2 MiR-200對腎癌細胞增殖影響

使用MTT法于24、48、72、96 h和120 h檢測腎癌細胞抑制率情況，SN12-PM6與786-o均對腎癌細胞有抑制作用，24 h內變化不顯著，48～72 h，MiR-200增長明顯放緩，超過72 h，抑制達到平臺期。見表2。

2.3 MiR-200抑制裸鼠腎臟腫瘤生長情況

兩組腫瘤形成率均為100%，形成率無差異，但MiR-200腫瘤重量明顯低于對照組，且免疫組化結果顯示，MiR-200的陽性率 （20%）也顯著低于對照組（80%）。見表3。

3 討論

隨著人類基因組計劃不斷進展，超過 1500個MiRNA已被發現，發現其調控超過30%的蛋白質編碼基因，MiRNA不僅參與人體重要的正常生理活動，而且還參與疾病的發生與發展[5]。研究表明[7]，超過一半的MiRNA位于腫瘤發生的基因上，和腫瘤關系密切。目前已證實MiRNA與多種腫瘤相關，而腎癌相關研究卻報道很少，該研究證實MiR-200在腎癌細胞中表達量明顯低于癌旁組織，因此推斷MiR-200在腎癌的發生、生長、轉移、侵襲中具有重要作用，通另根據不同時間截點測量人與裸鼠的抑制腎癌細胞增長發現，48～72 h，腎癌細胞抑制水平最為明顯，抑制率較高。而在裸鼠實驗中通過CDK2免疫組化染色比較，說明MiR-200能夠調節CDK2這個靶基因，從而抑制腎癌細胞的發生發展。研究表明[8]，每個MiRNA具有多個靶點，而一個靶點也同樣有多個MiRNAs對應，如MiR-200可調節細胞上皮間質的轉化[9]，可調節細胞凋亡[10]，該研究尚未針對具體位點和MiR-200作用降解靶基因的翻譯抑制機制以及不同階段阻斷細胞周期的研究，為下一步更系統深化的研究提出了新的方向與要求。

表2 MiR-200抑制腎癌增殖情況比較()

表2 MiR-200抑制腎癌增殖情況比較()

組別24 h 48 h 72 h 96 h 120 h SN12-PM6 miR-Ctr（n=20）miR-200（n=20）tP 786-o miR-Ctr（n=51）miR-200（n=51）tP 0.27±0.002 0.23±0.004 0.343 0.785 0.31±0.003 0.30±0.002 0.002 1.000 0.51±0.010 0.37±0.007 2.443 0.038 0.72±0.004 0.49±0.002 2.776 0.009 1.13±0.008 0.54±0.019 4.098＜0.001 1.97±0.006 1.01±0.009 5.473＜0.001 2.16±0.011 1.32±0.017 5.009＜0.001 2.53±0.006 1.55±0.004 5.558＜0.001 2.23±0.004 1.62±0.022 5.983＜0.001 2.65±0.012 2.02±0.010 4.972＜0.001

表3 兩組裸鼠腫瘤重量比較[(),mg]

表3 兩組裸鼠腫瘤重量比較[(),mg]

綜上所述，MiR-200在腎癌的增殖過程中具有重要意義，但是還需要具體明確MiRNA對下游靶基因的調控和反饋表達作用，也為腎癌如何抑制腫瘤提出了新的要求。

[1]王雪剛.MiR-200c抑制腎癌細胞增殖和侵襲轉移的機制研究[D].武漢：華中科技大學，2013.

[2]柳金順.腎細胞癌差異蛋白質發現與篩選的實驗研究[D].北京：北京協和醫學院，2009.

[3]趙亞偉,王礪,李前躍,等松.121例腎細胞癌患者臨床及預后分析[J].山東醫藥，2013(42)：55-56.

[4]那彥群，孫光，葉章群，等．中國泌尿外科疾病診斷治療指南（2014）[M]．北京：人民衛生出版社，2013.

[5]豐水強.局限性腎細胞癌腎切除后5年復發的臨床特征和預后[J].現代泌尿生殖腫瘤雜志，2011(4)：233.

[6]Tao Y,Guo Y,Liu W,et al.AKT inhibitor suppresses hyperthermia-induced Ndrg2 phosphorylation in gastric cancer cells[J].Braz J Med Biol Res,2013,46(4):394-404.

[7]Schena,F.P,Serino,G.,Sallustio,F.MicroRNAs in kidney diseases:New promising biomarkers for diagnosis and monitoring[J].2014,29(4):154-163.

[8]Mirzoeva,O.K,Collisson,E.A,Schaefer,P.M,et al.Subtypespecific MEK-PI3 kinase feedback as a therapeutic target in pancreatic adenocarcinoma[J].Molecular cancer therapeutics,2013,12(10):1124-1131.

[9]Abdel A M,Wassef M A,Ahmed H H,et al.The role of bone marrow derived-mesenchymal stem cells in attenuation of kidney function in rats with diabetic nephropathy[J]. DiabetolMetab Syndr,2014,6(1):34.

[10]Yan Xl,LiY,Xiao LX,et al.Regulation of colorectal carcinoma stemness,growth and metastasis by a miR-200c-Sox2 negative feedback loop mechanism[J].Clinical Cancer Research.2014 may15;20(10):2631-2642.

Analysis of the Effect of MiR200 on the Proliferation of Renal cell Carcinoma Cells

SHI Ying1,LIN Ling1,KAN Jia-yin1,LIU Hai-yan2,MA Zeng-wei1,LI Shuang-yu1
1.The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University，Department of Nephrology，Qiqihar，Heilongjiang Province, 161000 China;2.College of Pathology,Qiqihar Medical University,Micromorphological Experimental Center,Qiqihar，Heilongjiang Province,161000 China

Objective MiR200 proliferation of kidney cancer.Methods Group selection from January 2013-January 2015, 51 patients in the Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University with renal cell carcinoma pathological cells and adjacent normal tissue cells,renal cancer and build nude model,measuring MiR-200 in different cells and the expression of tumor proliferation.Results MiR-200 in nude mice SN12-PM6 and human 786-o,A498 expression were lower than normal tissue expression(P＜0.05),at 48h after kidney can inhibit cancer cell proliferation(P＜0.05),48～72 h inhibition was most significant,(P＜0.05).Conclusion MiR-200 showed low levels of expression in tumor cells,can inhibit the proliferation of renal cell carcinoma and renal cancer cell growth in nude mice can be suppressed.

MiR200；Renal cell carcinoma；proliferation

R737.11

A

1674-0742（2016）06（b）－0023-02

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.17.023

2016-03-18）

齊齊哈爾市科學技術計劃項目任務（FSGG201422）。

施瑩（1975.6-），女，本科，副主任醫師,研究方向：腎臟疾病。