白藜蘆醇對人腦膠質瘤U87細胞自噬的影響*

胡火軍，黃益玲，汪 雷，郭金滿，馬金陽

(1.三峽大學第一臨床醫學院/宜昌市中心人民醫院神經外科,湖北宜昌 443003；2.三峽大學醫學院病理學系,湖北宜昌 443002)

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白藜蘆醇對人腦膠質瘤U87細胞自噬的影響*

胡火軍1，黃益玲2△，汪 雷1，郭金滿1，馬金陽1

(1.三峽大學第一臨床醫學院/宜昌市中心人民醫院神經外科,湖北宜昌 443003；2.三峽大學醫學院病理學系,湖北宜昌 443002)

目的 研究白藜蘆醇對腦膠質瘤U87細胞自噬的誘導作用及其可能的作用機制。方法 分別用不同濃度的白藜蘆醇處理腦膠質瘤U87細胞12、24、48 h后，采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測白藜蘆醇對U87細胞生長的抑制作用；電子顯微鏡觀察藥物處理后U87細胞自噬空泡的出現；逆轉錄PCR及Western blot分別檢測白藜蘆醇作用后自噬相關基因微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3(LC-3)、抗Bax交互作用因子(Bif-1)mRNA及蛋白表達的變化。結果 隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長，白藜蘆醇對U87細胞的生長抑制作用逐漸增大。電鏡檢測發現未使用白藜蘆醇處理的細胞未出現自噬空泡，而白藜蘆醇處理過的細胞出現明顯的自噬空泡。白藜蘆醇能劑量依賴性地增強自噬相關基因LC-3、Bif-1 mRNA及蛋白水平的表達。結論 白藜蘆醇可以通過誘導細胞自噬來抑制U87細胞增殖，LC-3、Bif-1基因表達上調是其誘導自噬的可能機制。

神經膠質瘤；自噬；白藜蘆醇；U87細胞

白藜蘆醇(resveratrol)是含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于葡萄、松樹、花生等天然植物或果實當中,具有調節脂質代謝、抑制血小板聚集、保護心血管、抗炎、抗腫瘤等多種生物學活性[1-2]。近年來研究發現,腫瘤細胞中的自噬活動可以在一些治療因素作用下被激活,過度自噬導致的細胞死亡可以殺滅腫瘤細胞[3-4]。白藜蘆醇能否通過誘導自噬抑制腦膠質瘤的生長尚未見報道。本研究以人腦膠質瘤U87細胞為模型，探討白藜蘆醇對腦膠質瘤U87細胞的自噬誘導作用，并初步探討其作用機制，為白藜蘆醇的抗腫瘤作用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 白藜蘆醇購自Sigma 公司；DMEM培養基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibcobrl公司；RPMI 1640 培養基和FBS購自美國Gibcobrl公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)購自Amresco公司；Trizol總RNA抽提試劑購自Invitrogen公司；GeneRulerTM100 bp Plus DNA Ladders購自Fermentas公司(試劑來源見文獻[5])，引物由Sigma公司合成；一抗Bax交互作用因子(Bax-interacting factor-1,Bif-1)、β-actin、二抗辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG抗體購于Santa Cruz Biotechnology公司；微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3-β(LC-3)購自Cell Signal公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 腦膠質瘤細胞U87細胞為本室傳代保存，培養于5%CO2,37 ℃濕化孵箱中。培養基DMEM含10%胎牛血清(FBS)，0.1 U/L青霉素,0.1 g/L鏈霉素,取對數生長期細胞待用[5]。

1.2.2 MTT法測定 取對數生長期的U87細胞接種于 96 孔細胞培養板中(每孔2×104)，12 h后加入不同濃度的白藜蘆醇(0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μmol/L)，每個濃度設6個平行孔，繼續培養12、24、48 h，每孔加入5 g/L MTT 溶液 20 μL；繼續培養4 h后加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解，測定MTT-甲臜化合物在570 nm處的光密度(OD)值，按公式：相對抑制率=(1-試驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%計算細胞生長抑制率。

1.2.3 電鏡觀察細胞自噬小泡 U87細胞接種于12孔板，細胞密度70.0%～80.0%時，各孔分別加入不同濃度白藜蘆醇處理12 h，收集各組細胞，800 g離心10 min，冰磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞沉淀，2.5%戊二酸醛4 ℃固定過夜，0.5%四氧化鋨孵育30 min后，用含2.0%醋酸雙氧鈾的50.0%乙醇著色、脫水后，環氧樹脂812包埋，60 ℃聚合48 h，80 nm切片后枸椽酸鉛染色，采用JEOL100CX11透射電子顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 逆轉錄PCR(RT-PCR)檢測自噬相關基因LC3和Bif-1 mRNA的表達 收集經白藜蘆醇處理的U87細胞，用Trizol按說明書提取總RNA，nano drop測定RNA的水平，用逆轉錄酶和Oligo(dT)20引物合成cDNA第1鏈，合成條件為70 ℃ 5 min、37 ℃ 5 min、42 ℃ 60 min、70 ℃ 10 min。以反轉錄的cDNA為模板，所用引物，退火溫度(Tm)及產物長度見表1。PCR產物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外拍照分析。

表1 自噬相關基因引物序列

1.2.5 Western blot檢測自噬相關基因LC3和Bif-1蛋白的表達 按文獻[4]的方法，離心收獲細胞，加入適量的細胞裂解液(臨用前加入各種蛋白酶抑制劑)提取蛋白，調整蛋白水平,加入等量2×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳加樣緩沖液，置95～100 ℃沸水中變性5 min，行SDS-PAGE垂直電泳,電轉膜，加50 g/L脂奶粉于4 ℃冷庫封閉過夜。 PBST洗膜后，分別加相應一抗37 ℃孵育1 h，PBST洗膜；加相應二抗37 ℃孵育1 h，PBST洗膜，等量的電化學發光(ECL)發光液A和B混合后加至膜上1 min，最后X線片顯影。

2 結 果

2.1MTT法測定白藜蘆醇對U87細胞增殖的抑制作用 白藜蘆醇對U87細胞的生長抑制作用隨其濃度的增大而加強，與0μmol/L白藜蘆醇，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 不同濃度白藜蘆醇作用12、24、48 h對U87細胞的增殖抑制作用

2.2 白藜蘆醇對細胞自噬的影響 自噬是以細胞質空泡化為特征的依賴于溶酶體的一種降解途徑,在電子顯微鏡下可以觀察到自噬性空泡的出現。0μmol/L白藜蘆醇處理的U87細胞無明顯自噬空泡，經25μmol/L白藜蘆醇處理12h的U87細胞開始出現自噬空泡，50μmol/L白藜蘆醇處理U87細胞后出現的自噬空泡更為明顯，見圖2。

2.3 白藜蘆醇對細胞自噬相關基因mRNA的影響RT-PCR檢測發現，白藜蘆醇能增強自噬相關基因LC-3、Bif-1mRNA表達水平，并具有劑量依賴性，見圖3。

圖2 白藜蘆醇對細胞自噬的電鏡改變

圖3 白藜蘆醇對自噬相關基因LC-3、Bif-1 mRNA表達的影響(RT-PCR)

2.4 白藜蘆醇對自噬相關蛋白的影響Westernblot檢測發現，白藜蘆醇作用后可明顯升高LC3-Ⅱ水平，Bif-1的表達也逐漸升高，見圖4。

圖4 白藜蘆醇對自噬相關蛋白LC-3、Bif-1表達的影響(Westerm blot)

3 討 論

腦膠質瘤是最常見的顱內原發性腫瘤，約占顱內腫瘤的46%，具有侵襲性生長的特征，手術不易完全切除，術后復發率高，積極研究有效的抗腦膠質瘤藥物尤其必要[6]。從天然藥物中尋找能夠抑制腫瘤細胞生長的化合物單體或前體化合物，是目前國內外腫瘤治療藥物研發的熱點。白藜蘆醇屬于非黃酮類多酚化合物,近年研究發現白藜蘆醇對乳腺癌、前列腺癌、肝癌、白血病、皮膚癌等多種腫瘤細胞的生長均具有顯著的抑制作用[7]。白藜蘆醇抑制腫瘤細胞生長的機制不盡相同，Liu等[8]研究發現白藜蘆醇可通過PTEN/PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號通路抑制結腸癌細胞的生長。李明新等[9]研究發現白藜蘆醇能誘導黑色素瘤細胞發生凋亡，其發生機制與線粒體膜電位破壞，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性增強及B淋巴細胞瘤-2基因 (bcl-2)表達水平降低有關。

近年來，自噬性程序性細胞死亡吸引了越來越多科學家的關注，有關自噬研究的文獻在最近幾年呈爆炸式增長，自噬性程序性細胞死亡的研究可能會像細胞凋亡一樣成為近幾年科技領域的熱點之一[10-11]。細胞自噬在維持細胞的正常生長、發育中起著重要作用，自噬過度或自噬不足會導致疾病的發生[12]。

自噬性程序性細胞死亡的形態學特征主要表現為細胞質中出現大量包裹著細胞質和細胞器的空泡樣結構，即自噬空泡，同時伴有溶酶體對空泡內成分的降解。LC-3定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是細胞自噬泡膜的通用標記物[13]。在自噬泡形成的早期階段,LC-3的主要形式是LC3-Ⅰ。在哺乳動物E1泛素樣酶Atg7和E2泛素樣酶Atg3的催化下，LC3-Ⅰ與位于自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結合形成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅰ的相對分子質量為16×103，LC3-Ⅱ的相對分子質量為14×103。LC3從LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉變是自噬發生的標志之一，LC3-Ⅱ的水平或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例通常與細胞中自噬空泡的數量呈正相關[14-15]。

Bif-1,又名EndophilinB1，屬于Endophilin蛋白家族，它首先在Bax的綁定蛋白中被發現。最近研究發現，Bif-1介導Bax構象變化，激活Bax促凋亡功能，調控細胞凋亡通路[16]；另一方面，Bif-1可通過UVRAG蛋白與Beclin-1結合，從而激活VPS34蛋白，參與調控細胞自噬的發生[17-18]。

本研究用白藜蘆醇處理腦膠質瘤U87細胞，電鏡下可見明顯的自噬空泡，且從mRNA及蛋白水平均檢測到自噬相關基因LC-3和Bif-1表達水平的上調，表明白藜蘆醇作用后可以引發自噬過程的發生，誘導細胞自噬也是白藜蘆醇發揮腫瘤抑制作用的機制之一，有關白藜蘆醇誘導凋亡及引發自噬的相關關系尚待進一步研究。

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The effect of resveratrol on human glioma U87 cell autophagy*

HuHuojun1,HuangYiling2△，WangLei1,GuoJinman1，MaJinyang1

(1.DepartmentofNeurosurgery，theFirstClinicalHospitalofChinaThreeGorgesUniversity/CentralPeople′sHospitalofYichangCity，Yichang,Hubei443003,China;2.DepartmentofPathology,MedicalCollege，ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443002,China)

Objective To study the autophagy induction effect of resveratrol(Res) on glioma U87 cells and to explore the possible mechanism.Methods Glioma cell line U87 was treated with different concentration of Res.Cell growth inhibition was detected by MTT assay.Electronic microscope was used to observe the typical autophagic vacuoles.RT-PCR and Western blot analysis were used to detect the mRNA and protein expression level of LC-3 and Bif-1 gene.Results With the increase of drug concentration and the prolongation of action time,the inhibition effect of Res on the growth of U87 cells was gradually increased.Electron microscopic examination showed that the control group did not appear autophagic vacuoles,but the experiment group showed obvious autophagic vacuoles.Res increased the expression of autophagy related gene LC-3 and Bif-1 in both mRNA and protein levels in a dose-dependent manner.Conclusion Resveratrol could inhibit the proliferation of U87 cells by inducing autophagic cell death;the up-expression of autophagy related gene LC-3 and Bif-1 might mediate this process.

glioma；autophagy；resveratrol；U87 cell

湖北省自然基金面上項目(2014CFB682)；宜昌市中心人民醫院科研發展基金項目(KFJ2011005)。 作者簡介：胡火軍(1972-)，副主任醫師，博士，主要從事腦腫瘤方面研究。△

論著·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.008

R739.4

A

1671-8348(2016)23-3190-03

2016-04-16

2016-06-24)