重組人5型腺病毒H101聯合索拉非尼對肝癌細胞株HepG2的體外抑制作用

李璐璐，張秀，金蕭蕭，王彩蓮，陳蓉

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009；2.東南大學附屬中大醫院 腫瘤科，江蘇 南京 210009)

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·論 著·

重組人5型腺病毒H101聯合索拉非尼對肝癌細胞株HepG2的體外抑制作用

李璐璐1，張秀1，金蕭蕭1，王彩蓮2，陳蓉2

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009；2.東南大學附屬中大醫院 腫瘤科，江蘇 南京 210009)

目的：探討重組人5型腺病毒H101聯合索拉非尼(sorafenib)體外對人肝癌細胞株HepG2增殖及凋亡的影響。方法:將重組人5型腺病毒H101和索拉非尼分成單用組及聯合用藥組，作用于HepG2細胞，另設不加藥對照組。CCK-8法檢測HepG2細胞存活率，流式細胞術及DAPI染色檢測HepG2細胞凋亡。結果：重組人5型腺病毒H101及索拉非尼均可顯著抑制HepG2細胞增殖并誘導其凋亡；與重組人5型腺病毒H101或索拉非尼單用相比，兩藥聯合對HepG2細胞增殖抑制及誘導凋亡作用更為顯著(均P<0.05)。結論：重組人5型腺病毒H101、索拉非尼單用及聯用均能體外抑制HepG2細胞增殖并誘導其凋亡，且在特定索拉非尼濃度范圍內兩藥聯合存在協同作用。

肝細胞癌；重組人5型腺病毒H101；索拉非尼；協同作用

原發性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是消化系統常見惡性腫瘤之一，居全球常見惡性腫瘤第5位，是惡性腫瘤相關性死亡的第3位危險因素[1]。索拉非尼是第一個能使晚期肝癌患者生存獲益的靶向治療藥物，可用于治療不能手術切除或遠處轉移的原發性肝細胞癌[2-3]，但其治療晚期肝癌療效有限且不良反應發生率高，仍迫切需要新的治療手段提高肝癌的總體療效。目前，溶瘤病毒抗腫瘤正在受到廣泛關注。重組腺病毒H101是利用基因工程技術敲除了人5型腺病毒的E1B-55KD基因和E3區部分基因片段(78.3～85.8 μm)而獲得的一種溶瘤腺病毒，其可選擇性地在抑癌基因p53功能缺陷的腫瘤細胞中復制[4]。而E1B-55KD缺失的腺病毒在選擇性地殺傷p53基因缺失型肝癌細胞的同時對p53基因野生型肝癌細胞殺傷效果較差[5]。本研究將重組人5型腺病毒H101與索拉非尼相聯合，探討兩者對p53基因野生型肝癌細胞株HepG2的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人肝癌細胞株HepG2，購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.1.2 主要試劑與儀器 重組人5型腺病毒H101(上海三維生物技術有限公司)，索拉非尼(Apexbio公司，美國)以DMSO溶解，均-20 ℃保存；DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液(Gibco公司，美國)；CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、DAPI試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；酶標儀(Tecan Infinite F50，瑞士)；流式細胞儀(BD公司，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 使用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基，置于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱內培養肝癌細胞株HepG2，每周傳代2～3次。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖情況 將對數生長期HepG2細胞以5×103孔-1的密度接種于96孔板，各組設5個復孔，于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱內培養12 h后進行藥物干預。(1) 單藥干預：重組人5型腺病毒H101以不同感染復數(multiple of infection，MOI為0、10、100、200、500、1 000)處理HepG2細胞，分別繼續培養24、48、72、96 h；索拉非尼以不同濃度(0、2、4、6、8、10 μmol·L-1)處理HepG2細胞，分別繼續培養24、48、72 h。(2) 兩藥聯合干預：分設索拉非尼單藥組(sorafenib組)及重組人5型腺病毒H101聯合索拉非尼組(H+S組)。索拉非尼組各復孔加入含不同濃度索拉非尼的培養基使其終濃度分別為0、0.925、1.85、3.7、7.4、14.8、29.6 μmol·L-1；H+S組各復孔加入含重組人5型腺病毒H101的培養基使其MOI均為200，并加入索拉非尼使其終濃度分別為0、0.925、1.85、3.7、7.4、14.8、29.6 μmol·L-1，繼續培養48 h。各復孔加入CCK-8試劑10 μl，培養箱內孵育2 h，酶標儀上測定450 nm波長的OD值，計算細胞存活率(cell viability)，并根據金氏公式計算q值，評價兩藥間相互作用。細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 分設對照組(control組)、單藥重組人5型腺病毒H101組(H101組)、單藥索拉非尼組索拉非尼組、H+S組。將對數生長期HepG2細胞以2×105孔-1的密度接種于6孔板，12 h后進行藥物干預：H101組加入含重組人5型腺病毒H101的培養基使其MOI為200，索拉非尼組加入含索拉非尼的培養基使其終濃度為7.4 μmol·L-1，H+S組加入相應感染復數的重組人5型腺病毒H101和相應濃度的索拉非尼，對照組加入相應體積含0.1%DMSO培養基。培養48 h后，以不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后離心收集細胞，并以結合液重懸，依次加入5 μl Annexin V-FITC及10 μl碘化丙啶染色液，混勻，室溫避光孵育20 min，隨即流式細胞術檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 DAPI染色觀測細胞凋亡狀態 實驗分組及藥物干預同上。分組處理的HepG2細胞培養48 h后，去除舊培養基，PBS沖洗1次，福爾馬林固定30 min，PBS沖洗3次，室溫下DAPI染色10 min，PBS沖洗凈殘余染液，以熒光顯微鏡紫外光激發下觀測并拍照。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 重組人5型腺病毒H101及索拉非尼單藥對HepG2細胞的增殖抑制作用

重組人5型腺病毒H101對HepG2細胞存在顯著增殖抑制作用，且當MOI為200或更高時，細胞存活率無顯著差異，MOI等于200為H101對HepG2細胞的最適感染復數(圖1A)。索拉非尼亦可顯著抑制HepG2細胞增殖，并呈劑量-時間依賴性(圖1B)，經計算得其48hIC50為7.4μmol·L-1。

圖1 CCK-8法檢測重組人5型腺病毒H101及索拉非尼單藥對HepG2細胞存活率影響

Fig 1 Effects of H101 or sorafenib on cell viability of HepG2 cells via CCK-8 assay

2.2 重組人5型腺病毒H101聯合索拉非尼對HepG2細胞的增殖抑制作用

固定重組人5型腺病毒H101感染復數為200、索拉非尼濃度為0～0.925 μmol·L-1時對HepG2細胞的毒性作用小，隨濃度增加索拉非尼對HepG2細胞產生顯著增殖抑制作用(P<0.05)。索拉非尼濃度為0～3.7 μmol·L-1時，單藥索拉非尼組與聯合組對HepG2細胞的增殖抑制作用存在顯著差異(P<0.05)，且在此濃度范圍內兩藥聯合表現為協同作用。索拉非尼濃度達7.4 μmol·L-1時，兩組細胞存活率無顯著差異(圖2)。

與陰性對照比較，aP<0.05；與索拉非尼組比較，bP<0.05

圖2 CCK-8法檢測重組人5型腺病毒H101與索拉非尼聯合對HepG2細胞存活率影響

Fig 2 Effects of co-treatment of H101 and sorafenib on cell viability of HepG2 cells via CCK-8 assay

2.3 重組人5型腺病毒H101聯合索拉非尼對HepG2細胞凋亡情況影響

重組人5型腺病毒H101及索拉非尼單藥或兩藥聯合均能顯著誘導HepG2細胞的凋亡，且兩藥聯合較單藥作用更顯著(P<0.05，圖3)。DAPI染色顯示，熒光顯微鏡下，各給藥組均出現細胞密度減低，細胞核濃集、邊聚現象，且聯合給藥組的細胞凋亡現象更顯著(圖4)。

3 討 論

目前肝癌仍無特效的治療手段，外科手術及肝移植是肝癌的主要治療方法，但僅15%肝癌患者可接受此治療，且預后仍較差，中位生存期小于1年；其他傳統治療方式如射頻消融、經動脈化學栓塞(TACE)、放射治療、全身化療等使肝癌患者生存獲益均不顯著，索拉非尼分子靶向治療雖可一定程度提高肝癌患者總生存期，但療效有限[6]。

溶瘤病毒療法是指利用腫瘤細胞自身功能性基因的失活或缺失，使用可自主復制病毒靶向性感染并殺傷腫瘤細胞，而正常組織細胞免受破壞的抗腫瘤方式[7-8]。溶瘤病毒主要通過以下幾方面發揮抗腫瘤作用:(1) 選擇性感染并殺傷腫瘤細胞；(2) 破壞腫瘤血供；(3) 促進腫瘤相關抗原釋放，激發機體的抗腫瘤免疫[7]。腺病毒具有能夠感染分裂像和非分裂像細胞、對外源基因插入容量調節性強、不與宿主染色體整合及無內在致癌性的優點，使其成為溶瘤病毒抗腫瘤治療中研究最多的病毒載體[9]。然而溶瘤病毒抗腫瘤亦有其限制因素，如血清細胞因子的中和、機體單核吞噬系統的清除隔離、由腫瘤供血血管外溢受限以及瘤內擴散效果差等[7]。另外，惡性腫瘤常伴柯薩奇-腺病毒受體表達的下降，使腫瘤細胞對腺病毒易感性降低，也是影響溶瘤腺病毒抗腫瘤的重要因素[10]。

重組人5型腺病毒H101是利用基因工程技術獲得的溶瘤病毒。野生型人5型腺病毒的E1B55-KD基因產物通過抑制p53基因功能使其能在正常組織細胞中進行復制，敲除該區域后使重組人5型腺病毒H101選擇性在p53基因功能缺陷的腫瘤細胞中復制；E3區的基因片段可以編碼病毒死亡蛋白，去除后保證重組人5型腺病毒H101臨床應用的安全性[4]。既往研究表明，重組人5型腺病毒H101對肝癌、黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、鼻咽癌等惡性腫瘤均有顯著的抗腫瘤作用[11-15]。重組人5型腺病毒H101已被中國食品藥品監督管理局批準用于臨床頭頸部惡性腫瘤的治療。索拉非尼是一種口服多激酶抑制劑，具有雙重抗腫瘤作用：一方面通過抑制Raf/MEK/ERK信號通路直接抑制腫瘤細胞生長，另一方面通過抑制血管內皮生長因子受體、血小板源生長因子受體、纖維母細胞生長因子受體阻斷腫瘤新生血管的形成，間接抑制腫瘤細胞增殖和轉移[2-3]。已有多項將溶瘤病毒與化療、分子靶向治療相結合治療惡性腫瘤的體內外研究取得較好的抗腫瘤效果[11-12，16-17]。

與對照組比較，aP<0.05

圖3 流式細胞術檢測HepG2細胞凋亡

Fig 3 Detection of apoptosis in HepG2 cells by flow cytometry

圖4 DAPI染色檢測HepG2細胞凋亡(×400)

Fig 4 Detection of apoptosis in HepG2 cells by DAPI staining

本研究結果顯示，重組人5型腺病毒H101、索拉非尼單用或兩者聯合均可顯著抑制HepG2細胞增殖并誘導其凋亡。在重組人5型腺病毒H101感染復數為200時，其細胞增殖抑制作用與更高感染復數時無顯著差異，因此MOI等于200為其對HepG2細胞的最適感染復數。在索拉非尼濃度為0～3.7 μmol·L-1時，重組人5型腺病毒H101與索拉非尼聯合可協同抑制HepG2細胞增殖(P<0.05)，其中濃度為0.925 μmol·L-1時，其單用細胞毒性作用較小(P>0.05)，但與重組人5型腺病毒H101聯合對HepG2增殖可產生協同抑制作用，說明索拉非尼對重組人5型腺病毒H101細胞殺傷作用存在促進效應。在索拉非尼濃度達7.4 μmol·L-1時，重組人5型腺病毒H101作用逐漸不明顯，索拉非尼成為抑制細胞增殖主要因素。因此，重組人5型腺病毒H101僅與特定濃度范圍內索拉非尼聯合對HepG2細胞增殖起協同抑制作用。

綜上所述，重組人5型腺病毒H101聯合索拉非尼治療肝癌是一種有效的抗腫瘤方式，但索拉非尼濃度應控制在合適范圍內，否則聯合治療意義降低。本實驗結果可為溶瘤腺病毒聯合分子靶向藥物治療肝癌提供相關依據，并為臨床上肝癌的治療提供新的治療思路，但重組人5型腺病毒H101聯合索拉非尼聯合對不同細胞株的殺傷效果及相關機制仍須進一步研究。

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Inhibitory effect of recombinant adenovirus H101 combined with sorafenib against hepatocellular carcinoma HepG2 cellsinvitro

LI Lu-lu1，ZHANG Xiu1，JIN Xiao-xiao1，WANG Cai-lian2，CHEN Rong2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China；2.DepartmentofOncology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective:To investigate the inhibitory effect of recombinant adenovirus H101 combined with sorafenib on the proliferation and apoptosis of hepatocellular cell line HepG2invitro.Methods:HepG2 cells were treated with H101，sorafenib alone and in combination with the untreated cells used as control.The proliferation inhibition effect was determined using CCK-8 assay.Apoptosis was analyzed by flow cytometry and 4，6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining.Results:Oncolytic adenovirus H101 and sorafenib used alone or together both inhibited the proliferation of HepG2 cells and induced cell apoptosis.Compared with H101 or sorafenib alone，co-treatment led to a stronger antitumor effect in HepG2 cells.Conclusion:Oncolytic adenovirus H101 and sorafenib show a synergistic effect in inhibiting the proliferation and inducing apoptosis of HepG2 cells.

hepatocellular carcinoma; recombinant adenovirus H101; sorafenib; synergistic effect

2016-02-23

2016-04-25

國家自然科學青年基金資助項目(8121131)

李璐璐(1990-)，女，安徽淮北人，在讀碩士研究生。E-mail：836874736@qq.com

王彩蓮 E-mail:wangcailian65@hotmail.com; 陳蓉 E-mail:rr1977@163.com

李璐璐，張秀，金蕭蕭，等.重組人5型腺病毒H101聯合索拉非尼對肝癌細胞株HepG2的體外抑制作用[J].東南大學學報：醫學版，2016，35(5)：673-677.

R735.7

A

1671-6264(2016)05-0673-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.05．006