致病性大腸桿菌現狀分析及檢測技術研究進展

衛昱君王紫婷徐瑗聰，2許文濤，2

（1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2. 農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心，北京 100083）

致病性大腸桿菌現狀分析及檢測技術研究進展

衛昱君1王紫婷1徐瑗聰1，2許文濤1，2

（1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2. 農業部轉基因生物食用安全監督檢驗測試中心，北京 100083）

致病性大腸桿菌是一類常見的致病菌，能夠通過多種感染渠道導致大腸桿菌感染疫情大規模爆發，其耐藥性的出現引起廣泛擔憂的同時，也促進了新型抑菌方式的研究。目前大腸桿菌風險毒力因子作為致病的直接因素，備受國內外研究人員的關注。大腸桿菌檢測技術也相應獲得了較快的發展，相較傳統方法，新型的病原菌檢測技術能夠快速、特異、準確地檢測目標菌。結合國內外研究現狀從大腸桿菌的污染情況、感染途徑及癥狀、耐藥性、風險毒力因子及檢測方法等方面綜述了大腸桿菌毒力評估及檢測技術研究進展。

致病性大腸桿菌；現狀分析；檢測技術

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通常被稱為大腸桿菌，為埃希氏菌屬的代表菌種。有鞭毛及動力，為無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。大腸桿菌為兼性厭氧菌，生長溫度范圍是8-46℃，最適生長溫度為37℃。其菌體抗原為“O”型抗原，鞭毛抗原為“H”型抗原，表面抗原為“K”型抗原，根據其抗原結構的差異被分為180多種血清型別。致病性大腸桿菌是指能產生和攜帶腸毒素（LT、ST和SLT）、定居因子（CFA-Ⅰ和CFA-Ⅱ）、K抗原或類似物質，以及帶有性菌毛、能分泌內毒素的大腸桿菌。根據其不同的生物學特性可將致病性大腸桿菌分為6種類型［1］：產腸毒素性大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）、 腸侵襲性大腸埃希桿菌（enteroinvasive E. coli，EIEC）、腸致病性大腸桿菌（enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）、腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhage E. coli，EHEC）、腸聚集性大腸桿菌（enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）及彌散黏附性大腸桿菌（DAEC）。

自1885年Esherich發現大腸埃希氏菌以來，人們通常將其認作腸道菌群中的正常組成部分。直到1982年，Riley和Remis等［2］通過對當時美國密歇根州和俄勒岡州爆發的伴有腹瀉和腸出血的腸道疾病進行調查研究，首次發現這種不同尋常的腸道疾病是由腸出血性大腸桿菌O157∶H7感染所引起的，人們才意識到大腸桿菌具有致病性。此后30多年，致病性大腸桿菌引發的食物中毒事件不勝枚數［3，4］，事件爆發后需要對污染的菌體進行分析鑒定，明確其致病機制、耐藥情況等，才能對診斷做出有效的判定。因此探究致病性大腸桿菌的污染情況，能夠更加明確其容易侵染的基質，為食物中毒事件的分析提供參考；總結致病性大腸桿菌的感染機制及癥狀能夠協助對病發狀態做出更加準確的分析；分析耐藥性、致病因子及現有檢測技術能夠進一步研究新型快檢技術以及核酸診斷藥物等，對治療具有重要意義。基于此，本文結合國內外研究現狀從污染情況、感染途徑及癥狀、耐藥性、風險毒力因子及檢測方法等方面綜述了致病性大腸桿菌的現狀分析及檢測技術研究進展。

1 污染情況及限量情況

1.1 生物體污染

大腸桿菌O157所引起的疾病屬于人畜共患病，其中動物為重要的傳染源，可于宰前感染［5］，較常見的有牛、雞、羊、狗、豬等，動物的糞便中也常常能夠分離出O157∶H7大腸桿菌。其中以牛的帶菌率最高，可高達16%。

大腸桿菌常寄生于家畜及其奶中，或是被家畜糞便污染了的水中，以及用被污染了的水灌溉的作物中。人們食用了這些被污染過的食品，就可能引發腹瀉等癥狀。世界范圍內爆發的嚴重大腸桿菌感染事件中，幾乎都是由食物傳播引起的。屠宰與加工中的污染，肉類帶大腸桿菌，在加工烹調過程中加熱不徹底或生吃都會導致進食者感染［6］。

1.2 環境污染

大腸桿菌O157引起的環境污染主要在于土壤及水源。目前我國有關污水和禽畜糞便等隨意排放導致病原微生物污染環境的報道屢見不鮮［7］。腸道致病性微生物也是土壤中最為常見的病原菌，主要是通過糞肥的施用進入土壤，Gagliardi等［8］通過研究發現土壤中的大腸桿菌O157∶H7還具有向地表和地下遷移的特性。

在我國，類似的污染也不時被報道。周淑玉等［9］報道稱，用污水灌溉的土壤中糞大腸桿菌的檢出率高達93.9%。朱奇等［10］調查發現，使用被大腸桿菌及腸道致病菌污染的水源水灌溉導致2000年聊城上市蔬菜中，高達47%都受到不同程度的污染。由此可見，土壤與水源都是大腸桿菌污染傳播的重要媒介。葉小梅等［11］對江蘇省10家畜禽養殖場的排放物及周邊水、土樣進行了分析，并以糞大腸菌群和沙門菌為指標，結果發現10家養殖場中有9家廢物排放不合格，其中糞大腸菌群全部嚴重超標，施于土壤的糞肥中糞大腸菌群數在105/g以上，此外，從中分離出的大腸桿菌能夠表現出多重耐藥性。

大腸桿菌極易通過土壤作物進入人類食物鏈，引發大規模的傳染，因此保護灌溉水源及使用經過無害化處理的糞肥也是生態環境保護的重要工作。

1.3 國內外對于大腸桿菌的限量情況

針對致病菌的限量，不同的國家和地區有著相似標準，但食品微生物限量指示菌在不同的食品中標準限量值的差異很大［5］。歐盟對市場銷售的27類食品進行了微生物限量規定。以總菌落數、大腸埃希氏菌、腸桿菌科指示菌限量，對水果、蔬菜及其制品、乳與乳制品、肉及肉制品，以及水產品、蛋制品的加工進行了規范。歐盟對大腸埃希氏菌的限量采用三級采樣手段，在市場銷售的產品中僅限定了水產品，限量為n=1，c=0，m=230 MPN/100 g；在生產加工中限定的種類較多，規定在加工過程中果蔬制品及乳制品的限量為n=5，c=2，m=100 MPN/g，M=1 000 MPN/g；生產過程結束時加工生鮮肉的限量為n=5，c=2，m=50 MPN/g，M=500 MPN/g；乳制品的限量為n=5，c=2，m=10 MPN/g，M=100 MPN/g；水產品限量為n=5，c=2，m=1 MPN/g，M=10 MPN/g。澳大利亞、新西蘭微生物通用標準中，共26類食品涉及到微生物限量，其中14類食品具有指示菌限量，其中對大腸埃希氏菌做出限量的食品共有9種，在這9種食品中，礦泉水、瓶裝水、定型包裝的冰及豆腐中均不得檢出大腸埃希氏菌。此外，干酪中要求n=5，c=1，m=10 MPN/g，M=100 MPN/g，未經巴氏消毒牛乳中要求n=5，c=1，m=3 MPN/g，M=9 MPN/g，肉粉中要求n=5，c=1，m=3.6 MPN/g，M=9.2 MPN/g，雙貝殼類軟體動物要求n=5，c=1，m=2.3 MPN/g，M=7 MPN/g。加拿大主要對果蔬、乳制品、即食食品中菌落總數、大腸菌群作出限量以進行規范，22種具有指示菌限量的食品中，有15種對大腸桿菌做出限量。其中巴氏消毒奶制備的奶酪限定標準為n=5，c=2，m=100 MPN/g，M= 2 000 MPN/g，非巴氏消毒奶制備的奶酪限定標準為n=5，c=2，m=500 MPN/g，M=2 000 MPN/g，嬰兒配方食品的限定標準為n=5，c=1，m＜1.8 MPN/g，M=10 MPN/g，面制品及焙烤食品的限定標準為n=5，c=2，m＜1.8 MPN/g，M=1 000 MPN/g，經熱處理的發酵香腸的限定標準為n=5，c=1，m=10 MPN/g，M= 1 000 MPN/g，生的發酵香腸的限定標準為n=5，c=1，m=100 MPN/g，M=1 000 MPN/g，即食類香腸、豆制品、調味品以及鮮果蔬等的限定標準為n=5，c=2，m=100 MPN/g，M=1 000 MPN/g。

在我國于2010年新發布的15項乳制品產品標準中，針對11種產品規定了大腸菌群限量標準，分別是巴氏殺菌乳、調制乳、發酵乳、煉乳、乳粉、稀奶油/奶油/無水奶油、干酪、再制干酪、嬰兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品以及嬰幼兒谷類輔助食品。在《GB29921-2013 食品安全國家標準食品中致病菌限量》中，要求牛肉制品和生食果蔬制品中不得檢出大腸埃希氏菌O157∶H7，其他無說明。香港只是在即食食品中規定了菌落總數、大腸埃希氏菌的限量，要求大腸埃希氏菌的檢出量為20-100 CFU/g，方可認定為滿意級別。

2 大腸桿菌感染機制途徑與癥狀

2.1 感染途徑

根據眾多致病性大腸桿菌引發的食物中毒事件的分析可知，大腸桿菌的感染途徑有3種方式：食物傳播、水傳播、親密接觸傳播，其中食物傳播為最主要的感染途徑。在過去的40年內，較為嚴重的大腸桿菌爆發事件均是通過食物傳播引起的，例如美國爆發的O157食物中毒基本都與漢堡包肉餡有關，1996年日本爆發的疫情與進食牛肉、牛肝有關。另外，牛奶及其制品、生蔬菜、飲料等也常作為傳播介質，這些都是通過食品進行傳播的。通過水進行傳播主要是由糞便污染導致的。此外，通過親密接觸感染者，并可產生二代污染，二代病人出現的癥狀通常較輕，出血性腸炎的發病率很低。

2.2 感染機制與癥狀

腸產毒性大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是一類能侵染小腸上皮細胞的病原菌，能夠在細胞上定植和增殖，并產生腸毒素。腸毒素是由質粒或染色體編碼的，具有熱敏感或熱不穩定的特點［12］。腸道感染患者常伴有輕微或嚴重腹瀉，這類病原菌的感染對腸道的營養吸收、兒童的生長發育甚至于全球的死亡率都有著深遠的影響［13］。臨床上ETEC感染的癥狀通常為急性水樣腹瀉，有從溫和到嚴重多種程度。感染者也曾出現頭痛、發燒、惡心、嘔吐等癥狀。

腸侵襲性大腸桿菌（enteroinvasive Escherichia coli，EIEC）是一類具有強致病毒力的病原菌，能夠感染較大兒童及成年人。常見的臨床癥狀主要是水樣腹瀉，少數人出現痢疾癥狀，通常是以食物或水源為媒介進行感染的，也可經過親密接觸傳播產生散發病例［14］。

腸致病性大腸桿菌（enteropathic Escherichia coli，EPEC）是在小腸上段寄居繁殖的一類病原微生物，EPEC在1945年就被認定為致瀉大腸桿菌，主要引起嬰幼兒急性腹瀉或慢性腹瀉以及成人散發腹瀉。

腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）是一類毒力強、致病性高的病原菌，腸出血性大腸桿菌感染是一種人畜共患病，傳染源通常是帶菌者、感染病人及畜禽。其中牛的帶菌率最高，因此，牛肉、奶制品等動物來源食品通常是主要的污染源。畜禽的糞便同樣會對環境中的土壤和水源產生污染使其污染范圍更加廣泛。其主要臨床癥狀為右下腹劇烈疼痛、腹瀉、便血，并伴有低熱或不發熱，病程7-10 d，少數病人特別是幼兒及老人可并發溶血尿毒綜合征，病情較為嚴重［15］。

腸聚集性大腸桿菌（enteroaggregative Escherichia coli，EAEC）是Nataro等于1987年首次從智利腹瀉兒童的糞便中分離出的一種大腸桿菌，其特點是在組織培養過程中能以特有的“聚集樣”或“磚堆樣”的方式黏附于組織培養的上皮細胞株HEp-2，后被命名為腸聚集性大腸桿菌（EAEC或EAggEC）。其在侵染時不侵入腸上皮細胞，不產生LT、ST或是VT毒素，臨床表現為急性、持續性腹瀉和腹瀉，含粘液的水樣分泌性腹瀉是其典型表現，部分病人伴有發熱、嘔吐、腹痛，1/3病人有便血癥狀［16］。

彌散黏附性大腸桿菌（dispersion adhesion Escherichia coli，DAEC）的感染病例較為少見，該菌曾引起墨西哥兒童腹瀉從而被分離發現。

2.3 防范措施

針對致病性大腸桿菌的污染情況以及感染途徑，國家應加強對其監測力度，掌握大腸桿菌的分布特征及疾病流行趨勢并建立早期預警機制，一旦發生疫情立即進行診斷并及時預警，而后進行嚴密監測，及時防控，防止病情蔓延。中央還應對地方進行統一應急管理，疫情發生后及時向民眾通報實施狀況。有關部門還需加強對食品和水源的管理，并確保禽畜養殖場對污染物進行處理后排放。

個人也應加強衛生習慣以避免感染病原菌，應保持雙手清潔，飲用煮沸的自來水，避免進食未經徹底殺菌的帶菌率高的食物。體質較弱者及外出旅游者應補食乳酸菌，以細菌間的拮抗作用防止大腸桿菌的侵染。

3 大腸桿菌耐藥性的相關研究

3.1 耐藥性與菌株血清型

近年來的研究表明，血清型大腸桿菌已產生較高的耐藥性，且相對于其他血清型，O141含有更多的獨立因子。此外近些年研究結果表明O6、O8、 O18三種血清型的菌株普遍對氨芐西林產生較高抗性［17］，抗生素的濫用是細菌產生耐藥性主要原因。

3.2 耐藥性與毒力基因

相較于國內，國外對于毒力基因與耐藥性有更多研究。Ojo等［18］針對O157、O26、O91、O103、O111、O128、O145這7種產志賀毒素的大腸桿菌（shiga toxin Escherichia coli，STEC）進行了一系列研究，結果表明STEC菌株攜帶的主要毒力基因為Stx1、Stx2、EaeA及HlyA。STEC菌株對氨芐西林、四環素、鏈霉素及氯霉素等耐藥率超過40%。Soufi等［19］以從突尼斯家禽肉中分離出來的166株大腸桿菌為研究對象，對其抗藥性表現和基因型及其耐磺胺基因的側翼區及整合子進行了研究分析發現，大腸桿菌對氨芐青霉素、鏈霉素、萘啶酸、磺胺類及四環素都具有較高抗性，而對慶大霉素、阿莫西林-克拉維酸及頭孢西丁的抗性則不夠顯著，分析可知大腸桿菌攜帶的耐藥基因主要為Bla（TEM）、Tet（A）/Tet（B）、Aph（3’）-Ia，Aac（6’）-Ib-cr、Aac（3）-II及CmlA。因此，大腸桿菌針對氨芐西林、四環素及鏈霉素表現出明顯的耐藥性。

3.3 耐藥性與動物來源

根據近年來報道，禽畜肉及奶制品成為主要污染源。Ewers等［20］對禽致病性大腸桿菌進行研究發現，從已爆發疾病的病雞體內分離出的121株菌株、從健康雞糞便中分離出的211株以及從它們所生存的環境中分離的35株菌株中，有高達79.2%-89.3%的菌株存在耐藥性。de Jong和Bywater等［21］研究了從雞、豬、牛中分離的大腸桿菌對幾種新型抗生素（頭孢吡肟、頭孢噻肟和環丙沙星）的耐藥力，根據研究資料顯示，雖然大腸桿菌對這些新型抗生素表現出了較低的抗性，但從雞體內分離出的大腸桿菌對這些新型抗生素已經出現敏感性降低的現象。研究進一步表明，除歐洲國家外，相較于從牛源分離出的大腸桿菌，豬源、雞源分離出的通常具有更高的耐藥性及毒力基因。以上研究均說明不同動物來源的大腸桿菌有著不同的耐藥性。

4 風險毒力因子的研究

致病性大腸桿菌具有多種毒力因子，主要分為黏附素和毒素兩種類別。

4.1 黏附素和定植因子

黏附素是存在于細菌表面的某種特定的蛋白質結構或糖脂成分，存在于細菌的細胞壁、外膜蛋白、鞭毛、菌毛等結構中，能夠使細菌黏附到宿主靶細胞上，對細菌的定植起著重要的作用。黏附素又分為菌毛和非菌毛黏附物質［22］。大腸桿菌的17種黏附素主要存在于腸致病性大腸桿菌、產Vero毒素大腸桿菌（verocytotoxin-producing Escherichia coli，VTEC）和腸出血性大腸桿菌（EHEC）中，少數存在于腸聚集性大腸桿菌（EAEC）和腸產毒性大腸桿菌（ETEC）中，主要的寄主是人、牛、豬、兔等（表1）。對黏附素的研究在大腸桿菌的致病機制及診斷疫苗研制等方面具有重要意義。

表1 大腸桿菌的黏附素及寄主

4.1.1 菌毛黏附素 首次在豬和牛中分離出來的產腸毒素大腸桿菌中發現了菌毛和菌毛黏附素，后來又在人源大腸桿菌中發現［23］。最典型的是由腸致病性大腸桿菌（EPEC）產生的F4菌毛［26］。Devriendt等［27］通過研究發現F4菌毛是影響細菌黏附腸上皮細胞及影響腸上皮細胞分泌細胞因子（cytokine）的主要因素。已有研究表明腸上皮細胞通過分泌一些細胞因子調節腸道免疫系統，F4菌毛通過抑制IL-6和IL-8這兩種細胞因子的分泌使感染了產腸毒素大腸桿菌的仔豬產生嚴重的腹瀉現象。

4.1.2 非菌毛黏附素 Duguid等于1995年發現無菌毛的大腸桿菌也能造成紅細胞的聚集，非菌毛黏附素（Afa）家族由這些導致紅細胞凝集的血凝素組成，編碼基因位于質粒或染色體上［25］。Afa家族中的大腸桿菌可在Hep-2細胞、HeLa細胞或MDCK細胞周圍表現擴散粘連，這類大腸桿菌成為彌散黏附性大腸桿菌（DAEC），在這個家族中，還有一類大腸桿菌雖然不表現擴散粘連，但也可以聚集黏附到Hep-2細胞、HeLa細胞上，具有這些特點的大腸桿菌都叫做腸黏附性大腸桿菌（EAEC）［28，29］。

4.1.3 外膜蛋白 外膜蛋白（outer membrane proteins，OMPs）是一種非常重要的蛋白質，廣泛存在原核生物的細胞外膜和真核生物的細胞器外膜中。大腸桿菌的黏附素也能存在于外膜蛋白中，這種外膜蛋白能夠引發細菌與真核細胞之間的黏附。EPEC和VTEC兩種病原菌的質粒能夠編碼不同特異性的外膜蛋白從而使人和豬受到彌散黏附感染［26］。

4.1.4 定植因子 定植因子（colonization factors，CFs）是一類異質性蛋白質樣的表面結構，目前已發現至少25種定植因子，多數由質粒編碼。最常見的定植因子是CFA/A，包括其在內的已鑒別的定植因子中大多數被認為是糖蛋白偶聯物，除此之外仍有部分定植因子還未被鑒別［30］。

4.2 LEE毒力島及其主要編碼的致病基因

毒力島（pathogenicity islands）是編碼毒素、黏附素等一些毒力因子的毒力基因位于病原菌染色體上的特定區域［31］。EPEC的腸細胞脫落位點（LEE）毒力島包含了與黏附和脫落損傷（AE損傷）及一些其他毒力因子相關的所有編碼基因，主要編碼Ⅲ型分泌系統（ESC或SEP）、分泌型蛋白質（ESP）及其分子伴侶、外膜蛋白緊密素（EAE）和緊密素易位受體（TIR）等［32］。

Ⅲ型分泌系統是病菌分泌毒力蛋白或向宿主細胞注入毒力蛋白的通道，由多組分蛋白復合體形成，其一系列基因位于LEE的左側。位于LEE右側的Esps則編碼Ⅲ型分泌系統所要分泌的蛋白質。外膜蛋白緊密素（EAE）所有能引起AE損傷的病原菌都可檢測到的基因，或可檢測到其同源序列，是引起AE損傷的主要基因。Tir基因位于Eae基因前方，編碼一種成為宿主與致病菌結合橋梁的蛋白，是重要的體內致病因子。

4.3 毒素

病原微生物產生的毒素具有多種類型。有些病原菌可以產生寡肽毒素，寡肽素可黏附于胞質膜受體上并激活胞內聯級反應，從而干擾真核細胞新陳代謝，大腸桿菌可產生的寡肽毒素主要是耐熱腸毒素、熱穩定性腸毒素。有些病原菌產生AB毒素，這種毒素以A亞基為毒力中心，B亞基則使該毒素與細胞膜上受體結合，兩個亞基共同組成AB毒素的編碼區域。有的產生一種細胞溶解素-RTX毒素，這種毒素可以使細胞質膜產生縫隙，從而使得細胞溶解、死亡［33］。

5 國內外大腸桿菌檢測方法的研究進展

5.1 大腸桿菌傳統檢測方法

根據食品安全國家標準（GB 4789.3-2010）規定，現行的大腸桿檢測方法主要有兩種，大腸菌群MPN計數法和大腸菌群平板計數法，也是最為傳統的檢測方法。在MPN檢測法中，首先根據待檢菌在LST肉湯管中是否產氣來進行初步判斷，不產氣則判斷為大腸桿菌陰性，產氣的進行BGLB肉湯培養，若在BGLB肉湯中培養仍產氣則報告為大腸桿菌陽性，否則報告為大腸桿菌陰性，最后通過查MPN表計數。平板計數法是將10倍系列稀釋的菌液接種VRBA平板，計數典型可疑菌落，并接種可疑菌落于BGLB肉湯中，報告實驗結果。具體實驗材料及步驟可參見《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗大腸菌群計數》。

5.2 傳統檢測方法的劣勢及發展趨勢

傳統的大腸桿菌檢測方法耗時較長且操作復雜，不適合進行食品檢疫等大批量樣品的檢測。醫療中，如果檢測時間過長也可能會導致診治的延遲。因此，多年來相關研究人員一直致力于研究快速、靈敏、特異的大腸桿菌檢測方法。

5.3 新型檢測方法

5.3.1 免疫學檢測技術 主要包括酶聯免疫吸附技術、免疫層析技術、量子點熒光探針技術。

酶聯免疫吸附技術（ELISA）是指利用抗原抗體能夠特異結合的特性，使之產生顏色反應從而定性定量的進行分析。Ge等［34］建立了一種高靈敏度、高特異性的PCR-ELISA技術用于檢測大腸埃希氏菌O157∶H7以及其他產志賀毒素的食源性大腸桿菌。Galikowska等［35］利用噬菌體代替抗體，進行ELISA實驗用來檢測大腸桿菌O157∶H7，這種方法具有簡單、快速、經濟等特點。

免疫層析技術是通過毛細管作用使抗原或抗體與已知抗原抗體的微孔濾膜載體相連接，通過標記物進行定性檢測，具有快速，適用范圍廣、穩定易判斷等優點，但靈敏度稍顯遜色。Park等［36］應用免疫層析技術對大腸桿菌O157∶H7、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等病原菌進行了檢測，其中大腸桿菌O157∶H7的檢測范圍是9.2×103-9.2×105CFU/mL。Yonekita等［37］開發了一款免疫層析試紙從115種肉制品中成功檢測出5株E.coli O26菌株，檢測范圍是2.2×103到1.0×105CFU/mL。Cui等［38］應用膠體金免疫層析法結合免疫磁珠分離技術對大腸桿菌O157∶H7進行了快速檢測，該方法特異性強、靈敏度低，檢測限達10 CFU/g。

量子點熒光探針技術通過激發使量子點使其具有熒光特性，后與相關抗體結合形成熒光免疫復合物，從而通過復合物的熒光強度測定目標菌濃度。這種方法的優勢在于效率高、穩定性好且具有較高的靈敏度。Mitchell等［39］在免疫磁珠和DNA上修飾量子點，形成免疫磁珠-DNA-量子點復合物，對大腸桿菌O157∶H7的EaeA基因進行了特異性檢測，通過熒光檢測系統檢測反應后體系的熒光強度的大小來判定樣品中含大腸桿菌量的多少，該方法最低檢測限為49×10-15mol/L。Sanvicens等［40］建立了一種量子點熒光抗體陣列檢測大腸桿菌O157∶H7，最低檢測限為10 CFU/mL，相較于傳統的ELISA方法，這種方法將檢測限提高了3個數量級。

5.3.2 分子生物學檢測技術 分子生物學檢測技術主要是建立在PCR基礎上衍生出來的檢測方法。包括常規PCR、實時熒光定量PCR、多重PCR、基因芯片及新型核酸擴增技術等。

5.3.2.1 PCR 常規PCR技術是在短時間內對特定DNA序列進行大量體外擴增，后通過電泳技術完成特定序列的檢測。優點是能夠快速進行微量的檢測，且具有較高的靈敏度，但是容易產生假陽性。Sangdee等［41］針對腸桿菌基因重復序列（ERIC）設計引物用于大腸桿菌的檢測。該方法具有良好的特異性，檢測限100 CFU/ mL。

5.3.2.2 定量PCR 實時熒光定量PCR是在傳統PCR的基礎上發展起來的一種定量方法，通過在反應體系中加入特定熒光物質（熒光探針或核酸染料），對擴增產物進行跟蹤標記，也可進行實時監控，最后根據標準曲線進行監測分析。該方法優勢在于靈敏度較高，操作簡單，實現靶物質的定量分析。Wang等［42］針對大腸桿菌和志賀氏菌的Tuf基因設計特異性引物和探針實現了定量檢測，該方法操作簡便，短時間內能從生牛奶中同時檢測出兩種目標致病菌，其中大腸桿菌在102CFU/mL-106CFU/mL范圍內具有良好的線性關系。Kim等［43］針對大腸桿菌O157∶H7的EaeA基因設計了新引物和探針，實現了對鮮切卷心菜中的大腸桿菌O157∶H7的定量PCR檢測，檢測靈敏度提高兩個數量級至1.53 CFU/mL。Khatami等［44］開發了一種基于熒光PCR的特異性雜交方法（FLASH-PCR）檢測大腸桿菌O157∶H7中由STX編碼的Stx-1基因，實驗結果表明該方法與傳統方法檢測結果相符，與后者相比檢測過程更為快速、靈敏、簡單。

5.3.2.3 高通量PCR 高通量檢測技術是近幾年基于PCR技術發展起來的新技術，相比傳統的病原微生物檢測方法，該方法解決了每次只能檢測一種或一類樣品的局限性，其具有反應體系簡單、自動化操作程度較高、快速省時、無污染及診斷結果精確等特點。目前用于病原微生物鑒定的高通量檢測技術主要有：多重PCR技術、焦磷酸測序技術、二代測序、變性高效液相色譜分析技術和芯片技術等。

多重PCR是一種可以同時進行多個目標菌或基因檢測的技術，在反應體系中同時加入多種特異性引物即可擴增出多種DNA片段。這種方法的優點在于檢測速度快、特異性高及簡便高效。缺點在于反應體系中各種引物容易相互干擾，產生競爭性抑制。Son等［45］針對產志賀毒素大腸桿菌的Stx1、Stx2、Eae、EhxA及UidA五種毒力基因建立了多重PCR檢測方法，該方法有效提高了檢測的準確性，對其毒力基因的分析更加便捷，同時設計探針實現定量檢測。Gordillo等［46］針對大腸桿菌O157∶H7的FliCh7和 RfbE基因構建了引物和探針，建立了雙重定量PCR技術用于肉制品的檢測，檢測結果顯示本方法的準確度要優于傳統方法，兩個基因的結果均具有良好的線性關系。

隨著大規模基因組學的興起，二代測序技術（新一代測序技術）也隨之產生。二代測序技術大多采用大型矩陣結構的微陣列分析技術，使用引物和DNA聚合酶或連接酶擴展延伸核酸鏈。這種方法通過連續記錄光信號周期來獲取序列信息，可用于大規模的測序。市場上已有多種測序儀，如Illumina公司的Genome Analyzer及HiSeq 2000 系統，ABI公司的AB SoLid sequencer等。隨著2008年Helicos Biosciences公司的第一臺DNA分子測序儀的問世，基因組學迎來了新的發展時期，同時也為微生物檢測提供給了新的途徑。焦磷酸測序（Pyrosequencing）技術是在20世紀90年代年發明的DNA序列分析技術，這種技術是由酶級聯化學發光反應發展出的，該反應由4種酶（DNA聚合酶、三磷酸腺硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶）催化的同一反應體系產生。該技術是在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，當加入的這種dNTP能夠與模板進行配對時，聚合酶就會使其連接到引物鏈上，形成磷酸二酯鍵并釋放出等量的焦磷酸基團（PPi），通過檢測轉化為可見光信號的PPi量來確定參與反應中的核苷酸數目［47］。

雖然第二代測序技術在全球測序市場上占有絕對優勢，但新一代的測序技術又快速發展起來。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術，被稱之為第三代測序技術。與前兩代相比最大的特點就是單分子測序，并且在測序過程不需要PCR擴增。SMRT技術以SMRT芯片為測序載體邊合成邊測序，通過堿基配對發出光的波長與峰值來判斷插入的堿基類型。SMRT技術的測序速度達到每秒約10個dNTP，最大的劣勢就是測序錯誤率比較高。納米單分子測序技術基于電信號的測序技術，DNA穿過特殊的納米孔時，通過監測電荷變化從而鑒定所通過的堿基。第三代測序技術是為了解決第二代所存在的缺點而開發的，它最大的特點是單分子測序，且能避免由于PCR擴增造成的錯誤，極大的提高了測序長度，為微生物的測序分析提供了新的解決方法［48］。

變性高效液相色譜分析技術（denaturing highperformance liquid chromatography，DHPLC）是利用離子配對逆相層析的原理來分析核酸的檢測方法，這種方法利用離子配對試劑TEAA（triethylammonium acetate）在核酸非變性條件下與DNA的磷酸基團離子配對，帶正電的TEAA會將帶負電的核酸包裹，并以其非極性的烷基端吸附在非極性的固定相上，DNA因此滯留于分離管柱中。DHPLC系統對DNA片段的分離是基于其長度，而非序列，DNA鏈越長，所帶磷酸基團就越多，與之結合的TAEE就越多，其在柱內保留的時間也就相應增長。William等［49］通過不同譜系39種細菌進行DHPLC檢測，成功地把DHPLC技術應用于細菌菌種的鑒定。

基因芯片技術是指將與熒光標記探針結合后的樣品PCR擴增產物與芯片上的寡核苷酸進行雜交，通過熒光強度及分布進行分析鑒定。Suo等［50］對基因芯片進行了優化用于檢測食源性致病菌，并對26種鮮肉樣品進行了檢測。Kim等［51］對基因芯片技術進行了改進，使得檢出假陰性概率幾乎為零。

5.3.2.4 等溫PCR 等溫擴增技術的出現不僅使得反應時間大大縮短，同時也簡化了操作過程中所使用的儀器，大大滿足了快速簡便的要求。目前，多種基于PCR的等溫擴增技術逐漸發展起來，如核酸序列依賴的擴增（nucleic acid sequence based amplification，NASBA），高溫解旋酶依賴性擴增（thermophilic helicase-dependent amplification，tHDA），鏈置換擴增（strand-displacement amplification，SDA）， 環 介 導 等 溫 擴 增（loopmediated isothermal amplification，LAMP），滾環擴增（rolling circle amplification，RCA），重組聚合酶擴增（recombinase polymerase reaction，RPA）恒溫和嵌合引物引發的核酸擴增（chimeric primerinitiated amplification of nucleic acids，ICAN）以及切刻內切酶信號放大反應（nicking endonuclease signal amplification，NESA）。這些技術在反應速度、反應溫度、工藝簡化、對DNA或RNA的特異性、對酶的依賴、檢測范圍、引物設計及成本等方面都有著自身的優缺點［52］。

環介導等溫擴增（LAMP）是一種發展最為成熟的等溫核酸擴增技術，其反應溫度為60-65℃，是DNA雙鏈復性和延伸的中間溫度，DNA在此溫度中處于一種單雙鏈的動態平衡。依據6個區域設計4條引物，實現循環擴增，具有高效的特異性和靈敏度［53］。Wang等［54］利用這種技術對生乳中的大腸桿菌O157進行了檢測，同時結合核酸染料實現活細胞的檢測，檢測靈敏度是 PCR 方法的 1 000 倍。Wang等［55］分別針對產志賀毒素大腸桿菌的Stx1、Stx2和Eae基因設計引物，利用LAMP 技術對萵苣、菠菜樣品中的產志賀毒素大腸桿菌進行了檢測，該方法的準確性和靈敏度與定量PCR方法幾乎一致，其顯示了在食品中大腸桿菌現場快速檢測方面良好的應用前景。

5.3.2.5 ERIC-PCR 腸桿菌屬間的共有重復序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）是Sharples等［56］于1990年在大腸桿菌發現的一組序列，它具有一段保守性很高的反向重復序列，序列長約44 bp。雖然功能尚未研究清楚，但了解到其在基因組的分配比較均勻，且存在的位置和拷貝隨物種的不同而有差異。Versalovic［57］根據這一核心序列設計了反向引物，用于擴增ERIC兩端之間的片段，建立了ERIC-PCR技術。由于在不同種屬或同種不同菌株之間的拷貝數和定位都不同，通常被用于細菌基因組圖譜的研究，用于細菌的分類與鑒定。在應用該方法的過程中發現，ERIC結果的帶型和條帶的強弱易受PCR的反應參數和電泳條件的影響，因此有人建議將所有的樣本在相對集中的時間用同一條件進行分析，以保證其結果的可比性［58］。

5.3.3 死活菌檢測技術 傳統的死活菌檢測技術是根據每個活菌可以在平板上長出一個菌落來進行活菌計數的，但該方法局限于檢測能形成菌落的細菌，并且需要將菌液濃度稀釋到一定程度，因此，于PCR的新型死活菌檢測技術應運而生。目前發展出的主要有RT-PCR、EMA-PCR和PMA-PCR。

RT-PCR是以細菌中適當的mRNA作為靶基因，由于細菌死亡過后mRNA會快速降解，不會像DNA一樣降解緩慢，所以運用 RT-PCR 技術只能檢測到具有活性的細菌，從而避免了假陽性的出現［59］。EMA-PCR是根據疊氮溴乙錠（ethidiummonoazide bromide，EMA）能夠選擇性地進入死細胞的細胞膜內并與DNA發生不可逆的共價結合從而抑制DNA的PCR擴增，因此只有活菌能夠進行PCR擴增［60］。Shi等［61］對EMA的反應條件進行了優化，包括體系的溫度、pH、滲透壓，并記錄了EMA-qPCR 的檢測結果。當EMA染料進入死菌并與之核酸結合時，擴增反應會被抑制。研究還發現光的存在可以推動EMA與DNA的結合。優化后EMA的使用濃度為10 μg/mL，光照時間為20 min，加熱可以使不同狀態的細胞都能夠與EMA充分結合，對細胞進行85℃滅活35 min后，EMA-qPCR 即無法檢出活菌，說明了這種檢測方式的有效性。高滲透壓（≥4%）會對EMA-qPCR產生抑制，且滲透壓越高，抑制效果越明顯。當滲透壓達到8%時，EMA-qPCR擴增出的菌數量急劇減少。將細胞在不同的pH溶液中處理后再用EMA處理發現，pH從1升高到5時，其Ct值顯著增加，pH大于5以后無明顯變化，試驗中還發現pH為3時，細胞數量已經開始下降。用LB培養基對已經損傷酸化了的細胞進行40 min孵育，損傷的細胞即可復原且EMA不能進入到其內部。PMA-PCR是對于EMA-PCR的一種改進方法，由于疊氮溴化乙錠（EMA）具有細胞毒性，使得EMAPCR應用受限，因此，選用PMA來代替EMA進行死活菌檢測可以有效擴大其應用范圍，如臨床醫學、食品安全等領域［62］。

5.3.4 其他新型檢測技術

5.3.4.1 紅外光譜技術 紅外光譜技術主要用于測定微生物的傅里葉變換紅外光譜來獲得微生物及其生物大分子結構的信息，由此鑒定微生物種類及狀態。慈云祥等［63］利用紅外光譜技術對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌及谷氨酸菌進行了研究，大腸桿菌的實驗結果表明，培養時間不同、微生物含量不同對FTIR圖譜沒有明顯影響，并且測定出大腸桿菌的吸收帶波數為1 080和1 238 cm-1。Siripatrawan等［64］利用近紅外光譜技術結合化學統計學方法定性、定量地對大腸桿菌ATCC25922及大腸桿菌K12兩種菌株進行了分析檢測。

5.3.4.2 生物傳感器技術 傳感器分為3種類型：物理傳感器、化學傳感器及生物傳感器。目前用于微生物快速檢測的傳感器技術主要有電化學傳感器、光學傳感器等。電化學傳感器是微生物利用低電導率的大分子物質進行代謝，使其分解物帶有一定電荷，因此電導率發生變化，將電信號放大后記錄其變化即可對微生物量進行分析。此方法具有快速廉價等優點。光學傳感器是利用微生物產生的代謝產物使預先加入的指示劑變色，由光學檢測器檢測其顏色變化，找到突變點時間從而確定微生物的數量。

在各種類型的傳感器中，生物傳感器是最具優勢的一類，它具有敏感性、專一性，可以進行實時測定，且具有時效性。生物傳感器可與納米材料結合，用于測定核酸、酶、抗體、噬菌體甚至整個細胞。一種具有高特異性和敏感性的RNA生物傳感器被構建用于檢測具有活性的大腸桿菌，用mRNA（ClpB）基因構造的基于NASBA的生物傳感器可用于對活性大腸桿菌進行定性和定量［65］。Varshney等［66］構建了一種電阻生物傳感器，用于鑒定具有活性的大腸桿菌O157∶H7，如果細菌生長，就會監測到有電阻產生。Chang 等［67］利用EMA構造了一種微流控平臺，用于檢測區分有無活性的大腸桿菌，采用納米金探針對活性細胞進行探測，并使得具有生物活性的細胞得以擴增，這是第一次在同一微流控平臺上對活性細菌進行這兩項連續的操作。

側向層析檢測（lateral flow testsL，FT）及其試紙條已經成為實驗室的診斷工具，是一種基于紙張的生物傳感器，這種技術具有簡單、準確、快速、廉價的優點，不需要專業的技術或復雜的儀器。這種試紙條通常被膠體金、乳膠、碳、磷、單鏈核酸等標記，最常見的是膠體金粒子試紙條。目前，LFT被認為具有高效檢測細菌的巨大潛力，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌等都可以用這種試紙條進行快速檢測。

除了傳統的生物傳感器，一些新型的傳感器也被構建出來用于檢測一些特定的細菌。Li等［68］構建出了一種用于檢測大腸桿菌O157∶H7 的新型傳感器，這種傳感器采用了一種由二茂鐵與抗菌肽相組成的薄膜，其上的馬加寧抗菌肽為生物識別元件。Chan等［69］基于免疫傳感器研究出一種用于檢測大腸桿菌O157∶H7的生物功能磁珠，可用于在納米多孔氧化鋁膜上進行細菌細胞濃度的測定，這種傳感器具有高度的敏感性。

5.3.4.3 適配體 適配體是通過指數富集配體進化技術從體外篩選得到的一類單鏈寡核苷酸，能夠特異性的與靶分子結合并具有較高的親和性，是由Ellington和 Tuerk于1990年首次提出的［70-72］。適配體與靶分子的特異性結合基于其單鏈結構和空間結構的多樣性，高親和性基于核酸分子間的堿基互補配對、靜電作用、氫鍵以及其自身的適應性折疊。人們利用基于細胞層面的SELEX技術發現了一種僅結合于E. coli O157∶H7血清型菌株細胞表面的一種RNA適配體，該適配體還具有核酸酶抗性，這種在適配體可用于大腸桿菌O157∶H7菌株的特異性鑒別。化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）是一類曾引起過許多嚴重臨床疾病的致病菌，是A型鏈球菌（group A Streptococcus，GAS）的一種，目前發現一種能夠選擇性識別10種主要A型鏈球菌的DNA適配體序列，可用于A型鏈球菌的特異性檢測。

6 展望

目前，國內外大腸桿菌的疫情爆發依然時有發生，究其根本主要還是通過食物傳播。因此，大腸桿菌在分析、診斷、治療等各個方面均有待進一步的研究。隨著外界環境的影響，可能會引發大腸桿菌基因的變化，如基因突變、單核苷酸的多態性等，因此在今后的研究中，需要將研究重點向基因組、尤其是毒力基因的分析方面進行拓展，為大腸桿菌的風險評估提供更加可靠的理論基礎。隨著生物技術的大力發展，對于大腸桿菌的新型檢測方法不斷被開發應用，但快速、特異、靈敏、高通量仍然是新型檢測方法開發需要繼續改進方向，迎合企業及政府等現場篩查檢測的需求。目前研究重點均是圍繞檢測技術展開，因此在今后的研究中，需要將重點向尋找新的抑菌方法進行拓展，保證大腸桿菌的有效治療。

目前大量抗生素的使用使病原菌變得更加耐藥，為了防止動物感染病原菌，飼料中添加的大量抗生素最終使食用這些動物的人類產生耐藥性，針對此應加強對病原菌的監控以及抗生素類用藥的管理。此外，對于大腸桿菌新毒力因子的挖掘以及風險評估研究也應繼續拓寬、深入，掌握致病機理能夠方便人們針對不同的致病原因尋求更加有效治療方案。

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（責任編輯 狄艷紅）

Current Situation Analysis and Detection Techniques of Pathogenic Escherichia coli

WEI Yu-jun1WANG Zi-ting1XU Yuan-cong1，2XU Wen-tao1，2
（1.College of Food Science & Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083；2. The Supervision，Inspection and Testing Center of Genetically Modified Organisms，Ministry of Agriculture of P. R. China，Beijing 100083）

Pathogenic Escherichia coli is one of the most common pathogenic microorganisms. This kind of pathogen spreads through a variety of ways and its infection has caused many food safety accidents in the world. Though the emergence of its antibacterial resistance has raised concern，it also facilitates institutions and researchers to design new bacteriostatic methods. As direct pathogenic factor，E. coli risk virulence factor has drawn much attention by researchers. Also the technology of detecting E. coli developed rapidly too. Compared to traditional methods，advanced detection techniques for pathogens are fast，specific and accurate in determination of the pathogen. Based on the research status in domestic and abroad，this article introduces the research progress on assessments of E. coli virulence and techniques of detecting E. coli from several aspects such as the situation of E. coli’s contamination，infection route，symptoms，antibacterial resistance and its risk virulence factors，as well as detection techniques.

pathogenic E.coli；current situation analysis；detection techniques

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.011

2016-08-25

國家高技術研究發展計劃（“863”計劃）（2012AA101606），北京市科技新星計劃（XX2014B069）

衛昱君，女，本科；E-mail：weiyj95@foxmail.com

許文濤，男，副教授，博士生導師，研究方向：食品病原微生物的檢測技術和致毒機制、轉基因生物檢測和食用安全性評價等；E-mail：xuwentaoboy@sina.com