產幾丁質酶菌株S68-CM5產酶條件優化研究

胡基華曹旭，2孟力強，2陳靜宇姜威，2劉宇帥，2張淑梅，2李晶，2

（1. 黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010；2. 黑龍江省科學院高技術研究院，哈爾濱 150010）

產幾丁質酶菌株S68-CM5產酶條件優化研究

胡基華1曹旭1，2孟力強1，2陳靜宇1姜威1，2劉宇帥1，2張淑梅1，2李晶1，2

（1. 黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010；2. 黑龍江省科學院高技術研究院，哈爾濱 150010）

為提高黏質沙雷氏菌株S68-CM5產幾丁質酶能力，對產酶發酵條件進行優化研究。利用Plackett-Burman設計和響應面法對培養基和發酵條件進行摸索。結果顯示，獲得最佳發酵產酶培養基：膠體幾丁質1.5%，牛肉膏7 g/L，酵母膏2 g/L，葡萄糖8 g/L，氯化鈉 3.5 g/L，蛋白胨2 g/L，磷酸氫二鉀3.5 g/L；最佳產酶培養條件為：pH6.88，溫度27.32℃，搖床轉數155.82 r/min，培養時間60 h，接種量1%，裝液量50 mL/250 mL。優化后產酶量達到7.131 U/mL，比優化前產酶量提高了1.43倍。

黏質沙雷氏菌；培養基優化；響應面

黏質沙雷氏菌（Serratia marcescens）亦稱靈桿菌，是革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，屬于腸桿菌科克白雷氏菌族中的沙雷氏菌屬。在培養過程中，能產生紅色非擴散性色素-靈菌紅素（Prodigiosin）和幾丁質酶（Chitinase EC.3.2.14）［1］，幾丁質酶專一性水解幾丁質中的β-1，4糖苷鍵，轉化、產生菌體蛋白和氨基寡糖等產物，具有降解幾丁質的功能。到目前為止，已在細菌、放線菌、真菌中檢測到幾丁質酶，并且應用在食品、醫藥、化妝和動物飼料等行業，在害蟲防治中具有增效作用［2］。已有研究表明黏質沙雷氏菌是一類幾丁質酶產生能力較強的細菌，是幾丁質酶最好的來源之一。但由于幾丁質酶的多樣性，調控機理的復雜性，以及菌株產酶能力低下、發酵工藝不成熟等原因，真正應用于生產實際的并不多見。因此，獲得其最佳產酶條件是微生物產幾丁質酶研究的重要任務。

本研究是基于對本實驗室自有菌株黏質沙雷氏菌S68誘變基礎上，獲得產酶量高的新菌株S68-CM5的后續研究，利用Plackett-Burman設計和響應面法對培養基和培養條件進行實驗，對幾丁質酶的最佳培養條件進行優化，旨為黏質沙雷氏菌液深層發酵和生產幾丁質酶新型植物保護劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 黑龍江省科學院微生物研究所生物工程重點實驗誘變黏質沙雷氏菌株S68-CM5。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 斜面培養基 葡萄糖5 g/L，牛肉膏1.5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏3 g/L，NaCl 3.5 g/L，K2HPO43.65 g/L，瓊脂15 g/L，初始pH為7.0-7.5。

1.1.2.2 種子培養基 葡萄糖5 g/L，牛肉膏1.5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏3 g/L，NaCl 3.5 g/L，K2HPO43.65 g/L，初始pH為7.0-7.5。

1.1.2.3 基礎發酵培養基 葡萄糖5 g/L，牛肉膏1.5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏3 g/L，NaCl 3.5 g/L，K2HPO43.65 g/L，1%質量百分比膠體幾丁質以10%濃度加入培養基中，初始pH為7.0-7.5。

培養基滅菌條件均為濕熱滅菌121℃，20 min。

1.2 方法

1.2.1 種子培養

1.2.1.1 種子活化 將黏質沙雷氏菌種S68-CM5轉接到斜面培養基上，30℃培養24 h。

1.2.1.2 種子培養 挑一環斜面培養基上的菌株接種于5 mL試管種子培養基中，30℃培養 150 r/min培養16 h。

1.2.1.3 發酵培養 將種子液以1%接種量接種于250 mL裝三角瓶基礎發酵培養基中，三角瓶裝液量為50 mL，30℃培養150 r/min培養60 h。

1.2.2 酶活力測定 將培養60 h的菌液離心（7 000 r/min，-4℃，30 min）取上清液，以35%濃度使用硫酸銨進行蛋白沉淀，24 h后離心（7 000 r/min，-4℃，30 min）留取上清液，再以75%濃度硫酸銨沉淀蛋白，24 h后離心（8 000 r/min，-4℃，30 min），取沉淀物使用半透膜（MW7000）用流動水除鹽8 h；使用聚乙二醇6000濃縮至1 mL左右；取0.4 mL樣品，0.4 mL蒸餾水空白對照，分別加入0.4 mL濃度為0.05 mol/L醋酸液，0.4 mL 1%膠體幾丁質37℃水浴（2 h）降解幾丁質成單糖；離心（4 000 r/min，4℃，10 min）取0.4 mL上清液加入40 μL質量百分比為1%蝸牛酶水浴（37℃，30 min），加入0.2 mL飽和硼砂緩沖；干式恒溫器100℃，7 min，冷卻再加入2 mL冰醋酸和1 mL濃度1% DMAB水浴（37℃，15 min）進行顯色反應，585 nm測吸光度。根據N-乙酰-D-氨基葡萄糖（NAG）標準曲線計算酶活力［3］。酶活力單位（U）表示在上述反應條件下，每1 min時間內產生1 μmol NAG所需要的酶量。

1.2.3 基礎發酵培養基中的顯著因子篩選

1.2.3.1 試驗設計 采用Plackett-Burman進行試驗設計，篩選7個組分：葡萄糖（A）、牛肉膏（B）、蛋白胨（D）、酵母膏（E）、NaCl（G）、K2HPO4（H）和膠體幾丁質（J），選用10因子2水平的試驗設計，增加3個空白項C、F、I來估計試驗誤差，每個因子取高低2個水平，且高水平是低水平的2倍（表1）。

1.2.3.2 爬坡試驗 通過對Plackett-Burman設計的試驗結果進行分析，確定主要因子，根據回歸方程各因子的系數來確定主要因子的爬坡路徑和步長［4］。改變各主要因子在基礎發酵培養基中的質量濃度，使其成梯度變化，檢測各個梯度下菌株的酶活，快速確定最大響應值的區域。

1.2.4 響應面方法對培養條件試驗

1.2.4.1 培養條件各因素篩選 采用Plackett-Burman進行試驗設計，篩選的6個因素分別是pH值、接種量、培養溫度、搖床轉數、培養時間和裝液量，選用10因子2水平的試驗設計，增加3個空白項C、F、I來估計試驗誤差，每個因子取高低兩個水平（表2）。

1.2.4.2 Plackett-Burman主要因子 確定影響SM68-CM5菌株產酶條件的3個主要因素，爬坡試驗確定3個主要因子響應區域，采用Box-Behnken的中心組合設計原理在主要因子的響應區各取3個水平，設計3因素3水平的響應面分析試驗。

表1 Plackett-Burman分析碳源、氮源與水平試驗設計

表2 Plackett-Burman分析培養條件優化因素與水平

1.2.5 數據分析 每個處理包含3個平行試驗，取值為3個平行試驗的均值。Plackett-Burman設計采用Minitab 16軟件完成，Box-Behnken設計的響應面分析由Design-Expert8.0.6.1完成。

2 結果

2.1 黏質沙雷氏菌S68-CM5產幾丁質酶培養基組成的優化

2.1.1 Plackett-Burman設計篩選培養基碳氮源顯著因子 采用Plackett-Burman 設計對膠體幾丁質、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、NaCl和K2HPO4

7個因素每個組分取高水平（＋1）和低水平（-1），

各因子所代表的高低水平和方差分析結果，見表3。由表4中P值的大小可以判定，培養基中各因子對S68-CM5菌株酶活影響，膠體幾丁質P值為0.003，J＞B＞E＞A＞G＞D＞H，即膠體幾丁質＞牛肉膏＞酵母膏＞葡萄糖＞氯化鈉＞蛋白胨＞磷酸氫二鉀。效應關系用方程式表示為：W=4.25+X1+0.87X3+ 2.4X4，方程R2=0.9021，表明該回歸方程擬合良好。從方程中還可以看出，要提高菌體數量，應提高膠體幾丁質、葡萄糖和牛肉膏添加量。

表3 Placket-Burman設計與響應值

表4 Placket-Burman設計顯著因子分析

2.1.2 最陡爬坡試驗研究最大響應值的響應區域 根據Plackett-Burman 試驗設計法篩選出的主要組分的效應大小設計它們的步長，進行最陡爬坡試驗設計，尋找產酶量最高的濃度。試驗設計及結果如表5所示，最佳菌體數量在試驗號3附近。

確定了顯著因子的最適濃度區域之后，即以1.5%膠體幾丁質，牛肉膏7 g/L，酵母膏2 g/L，各因素代碼和水平設計，見表5。

2.2 黏質沙雷氏菌S68-CM5產幾丁質酶培養條件優化

2.2.1 Plackett-Burman篩選顯著因子 采用Plackett-Burman設計對主要6個培養因素進行分析。每個因素取高水平（+1）和低水平（-1），各因子所代表的高低水平和方差分析結果，見表6。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果

表6 Placket-Burman設計與響應值

由表7中P值的大小可以判定，培養條件各因子對S68-UM5菌株酶活影響，pH0.011，搖床轉速0.015，培養溫度0.021，A＞D＞E＞G＞B＞H，即pH＞搖床轉數＞培養溫度＞培養時間＞接種量＞裝液量。顯然，pH、搖床轉數和培養溫度的影響較為突出。

表7 Placket-Burman設計顯著因子分析

2.2.2 響應面試驗結果 Box-Behnken試驗結果見表8，確定了影響酶活最顯著3個因子為pH值、溫度和搖床轉數。以pH7.0，溫度28℃，搖床轉數150 r/min為中心點，設計3因素3水平的響應面實驗，每個處理設定3個重復試驗，以酶活為響應值。

表8 響應面試驗設計與結果

方差分析結果表明，該模型的一次項和二次項對酶活的影響均顯著，而交互作用酶活的影響不顯著，回歸模型的P值0.037 2，表明模型是顯著的，而失擬項的P值為0.159 1，失擬不顯著；模型的決定系數R2=0.910 7，說明模型達到較好的擬合程序，經分析軟件回歸擬合得到該模型的回歸方程：酶 活=0.65-0.14A-0.24B+0.17C+7.500E-003AB-0.075AC+0.40BC-0.34A2-0.37B2-0.25C2。

為解得該同回歸方程的極值點，對其各自變量分別求一階偏導，得到三元一次方程組，解出該模型的極值點，從而計算出對應因素的取值：pH6.88，溫度27.32℃，搖床轉數155.82 r/min，此時模型的理論最高酶活為7.092 U/mL。

根據擬合回歸方程采用Design-Expert8.0.6.1分析，繪出主要因素相應的等高線和響應面分析圖（圖1-圖3）。每個響應面可反映出兩個主要因素之間的相互作用，3個因素固定在最優值不變的情況下，隨著另外2個因素的逐漸增加，酶活呈先增后減的趨勢，而曲面的頂點即為酶活的最大值點［5］。

2.3 驗證試驗

根據分析（表5和表8）結果，鑒于實驗室條件，實際設定值為：pH7，溫度28℃，搖床轉數155 r/min，培養時間60 h，接種量1%，裝液量50mL/250 mL。為了驗證這一結果的有效性，按照上述分析結果進行重復試驗，檢測結果為7.131 U/mL，與預測值相近，說明該模型擬合的有效性。

圖1 pH值和溫度交互作用對酶活影響的等高線（A）和響應面（B）

圖2 pH值和搖床轉數交互作用對酶活影響的等高線（A）和響應面（B）

圖3 溫度和搖床轉數交互作用對酶活影響的等高線（A）和響應面（B）

3 討論

Plackett-Burman設計是一種以不完全平衡塊（Balanced incomplete blocks）為原理的部分因子設計法［6，7］，具有試驗次數少效率高的特點，Wu和陳寧等［8，9］都利用PB設計通過12次試驗，從10種成分中快速篩選出主要影響發酵產酸的成分。目前國內外許多研究都采用響應面設計法對不同微生物培養基進行優化，均獲得較為理想的結果［10，11］。

碳源是影響微生物發酵的最主要因素之一，本研究發現膠體幾丁質是誘導S68-CM5產幾丁質酶主要的碳源，這與大多數幾丁質酶為誘導酶有關［12］，幾丁質濃度在1.5%時酶活5.29 U/mL，膠體幾體質濃度高的情況下酶活反而下降，可能是由于幾丁質濃度高，黏稠度低利于酶產生。葡萄糖作為碳源時不利于幾丁質酶分泌，與王海東［13］研究的SWCH-6菌株及楊紹青［14］研究的一株高溫紫鏈霉菌結果相似。常用氮源中牛肉膏和酵母膏對產酶有影響。

通過PB從7個因素篩選出3個影響產酶的主要因素，利用響應面分析法Box-Behnken設計確定顯著因子最優配比：pH6.88，溫度27.32℃，搖床轉數155.82 r/min。幾丁質酶最適催化pH范圍較廣，一般在3.0-11.0之間，大多數微生物幾丁質酶最適催化在pH4.0-6.0的偏酸環境，在已有的研究中SWCH-6的最適pH值為5.0，本研究菌株S68-CM5的最佳pH值6.88，具有一般幾丁質酶的特點。從產酶的歷程看，S68-CM5從48 h開始分泌幾丁質酶，在60 h時達到產酶高峰，與以往文獻報道幾丁質酶活力高峰一般出現在4-8 d相比［14，15］，產酶時間提前，提高了產酶效率。

目前，多種統計優化方法已被成功地運用于微生物培養基和培養條件優化工作中，本實驗優化確定了誘變菌株S68-CM5培養基碳、氮源和最佳產酶條件，尋找合適的發酵工藝、探索使酶活穩定的方法，從而推動幾丁質研究及相關產業的發展。下一步打算在此研究的基礎上對S68-CM5菌株進行中試研究，利用20 L自控罐研究黏質沙雷氏菌誘變菌株S68-CM5發酵條件，探討誘導底物、底物濃度及添加時間對產酶量的影響；優化幾丁質酶的提取和純化工藝，提高酶的收率。

4 結論

得到黏質沙雷氏菌S68-CM5最佳產酶培養基：膠體幾丁質1.5%，牛肉膏7 g/L，酵母膏2 g/L，葡萄糖8 g/L，氯化鈉 3.5 g/L，蛋白胨2 g/L，磷酸氫二鉀3.5 g/L；最佳產酶培養條件：pH6.88，溫度27.32℃，搖床轉數155.82 r/min，培養時間60 h，接種量1%，裝液量50 mL/250 mL，優化后產酶量達到7.131 U/mL。

［1］ 鄭愛萍, 李平. 細菌幾丁質酶研究進展［J］. 中國生物工程雜志, 2002, 22（4）：74-79.

［2］ Dahiva N. Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes：a review［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 71（6）：773-782.

［3］胡基華, 陳靜宇, 曹旭, 等. 高產幾丁質酶的黏質沙雷氏菌株的誘變選育［J］. 東北林業大學學報, 2016, 44（3）：106-109.

［4］褚以文. 微生物培養基優化方法及其OPTI優化軟件［J］. 國外醫藥（抗生素分冊）, 1999（2）：58-60, 66.

［5］ 劉志祥, 曾超珍. 響應面法在發酵培養基優化中的應用［J］.北方園藝, 2009（2）：127-129.

［6］張廣臣, 雷虹, 何欣, 等. 微生物發酵培養基優化中的現代數學統計學方法［J］. 食品與發酵工業, 2010（5）：110-113.

［7］李勇昊, 周長海, 丁雷, 等. 發酵培養基優化策略［J］. 北京聯合大學學報：自然科學版, 2011（2）：53-59.

［8］ Wu QL, Chen T, Gan Y, et al. Optimization of riboflavin production by recombinant Bacillus subtilis RH44 using statistical designs［J］. App Microbiol Biotechnology, 2007, 76（4）：783-794.

［9］陳寧, 常高峰, 張克旭. L-異亮氨酸發酵培養基的響應面法優化［J］. 食品與發酵工業, 2004, 30（2）：33-37.

［10］李志華. 基于PB試驗和響應面分析法對谷氨酸棒桿菌CN1021發酵培養基優化［J］. 中國釀造, 2014, 2：23-27.

［12］Muthu M, Lejla P, Vijayaraghavan K. Optimization of growth media for obtaining high-cell density cultures of halophilic archaca（family Halobacteriaceae）by response surface methodology［J］. Journal of Biochemical Technology, 2009, 100（12）：3107-3112.

［13］王海東, 陳飚, 倫鏡盛, 等. 產幾丁質酶菌株SWCH-6的篩選、鑒定及其產酶條件的優化研究［J］. 微生物學通報, 2008, 35（5）：705-711.

［14］楊紹青, 張舒平, 閆巧娟. 高產幾丁質酶高溫紫鏈霉菌的篩選和發酵條件優化［J］. 中國農業大學, 2013, 18：167-173.

［15］尹璐, 祖國仁, 孫浩, 等. 一株海洋細菌產幾丁質酶培養條件研究［J］. 中國釀造, 2010（9）：101-105.

（責任編輯 狄艷紅）

Optimizing the Enzyme-producing Conditions of Chitinase-producing Strain S68-CM5

HU Ji-hua1CAO Xu1，2MENG Li-qiang1，2CHEN Jing-yu1JIANG Wei1，2LIU Yu-shuai1，2ZHANG Shu-mei1，2LI Jing1，2
（1. Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010；2. Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010）

In order to improve the capacity of Serratia marcescens strain S68-CM5 producing chitinase，the fermentation conditions of enzyme production were optimized. Using Plackett-Burman design and response surface method，the conditions of medium and fermentation were explored. The results showed that the optimal enzyme production medium：1.5% colloidal chitin，beef extract 7 g/L，yeast extract 2 g/L，glucose 8 g/L，NaCl 3.5 g/L，peptone 2 g/L，and hydrogen phosphate dehydrate potassium 3.5 g/L；the optimal culture conditions for enzyme production：pH6.88，temperature 27.32℃，shakers revolutions 155.82 r/min，incubation time 60 h，and inoculums size 1% liquid volume 50 mL/250 mL. After optimization，the enzyme production reached 7.131 U/mL，and 1.43 folds of that before optimization.

Serratia marcescens；medium optimization；response surface

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.027

2016-03-20

黑龍江省院所基本應用技術研究專項課題，黑龍江省科學院學科團隊創新能力提升專項（2014ws09）

胡基華，女，副研究員，研究方向：生物防治；E-mail：158631375@qq.com

李晶，女，研究員，研究方向：農業微生物；E-mail：lijing0706@sohu.com