谷胱甘肽合成酶系CLEAs的制備及應用

田慧 楊峰晨 盧泓宇 徐期 楊勇

（浙江海正藥業股份有限公司，臺州 318000）

谷胱甘肽合成酶系CLEAs的制備及應用

田慧 楊峰晨 盧泓宇 徐期 楊勇

（浙江海正藥業股份有限公司，臺州 318000）

為在谷胱甘肽合成工藝中降低成本，同時能夠實現酶的可存儲性、商品化性，將谷胱甘肽合成酶系經過合適的沉淀劑沉淀，戊二醛交聯制備成共固定交聯酶聚集體。通過優化沉淀條件，交聯條件，蛋白濃度及添加劑的使用，最終得到最優的制備方法為：在4℃，30 g/L蛋白濃度條件下，加入PEI-600（添加劑w∶酶液蛋白w=1∶5）與酶液進行充分混合，然后加入60%飽和度硫酸銨沉淀4 h，最后以0.5%戊二醛進行交聯。最終蛋白沉淀率為94.9%，酶活回收率為48.2%，單位CLEAs的酶活為4.9 U/g，分別相比對照組的28.7%及2.57 U/g提高了19.5%和2.33 U/g，GSH最高產量達到11.26 g/L，在轉化第12批次時GSH產量為9.03 g/L，相對酶活力為78.4%，4℃條件下儲藏33 d后相對酶活力為92.12%。經優化制備條件后得到的谷胱甘肽合成酶系CLEAs有較高的初始酶活力，能穩定轉化10批次以上，儲藏穩定性佳，具有優良的工業化前景。

谷胱甘肽合成酶系；固定化；交聯酶聚集體；添加劑

谷胱甘肽（GSH）是一種含γ2谷氨?；蛶€基的生物活性三肽類化合物，在蛋白質和DNA的合成、氨基酸的轉運、細胞的保護等重要的生物學現象中起著直接或間接作用。酶法合成谷胱甘肽是以L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸為底物，在谷氨酰半胱氨酸合成酶（酶A）、谷胱甘肽合成酶（酶B）、乙酰磷酸激酶的催化作用下合成。但在生產上未純化過的游離酶的使用導致生產后期雜質較多，分離純化工藝復雜，同時由于游離酶的一次性使用，導致生產成本居高不下。相比游離酶，固定化酶具有存儲穩定性高、分離回收容易、可多次重復使用的優點，能夠使得生產過程簡化，生產效率得到提高。目前對于谷胱甘肽的固定化酶生產，國內外的文獻報道相對較少，日本的Murata等［1］最早將釀酒酵母固定在聚丙烯酰胺凝膠中，利用釀酒酵母自身的糖酵解途徑作為ATP再生系統進行GSH的生物合成，國內很多學者也利用酵母細胞的糖酵解系統產生ATP進行GSH的合成［2］；李華鐘、陳堅等［3］將酵母菌的糖酵解酶系與重組大腸桿菌的谷胱甘肽合成酶系共固定化于改進的聚乙烯醇（PVA）-卡拉膠混合載體；趙旭東等［4］將酵母細胞固定化，再與GSH合成酶合成GSH，最終GSH產量為0.91 g/L，轉化率為14.9%。華東理工大學沈立新等［5］分別以卡拉膠、明膠、海藻酸鈉包埋E. coli BL21（pTrc-gsh）細胞催化合成谷胱甘肽GSH。南昌大學謝雷波等［6］提出了κ-卡拉膠與魔芋粉混合載體固定化微生物細胞進行生物合成谷胱甘肽的研究?？傮w來說，關于固定化酶生產GSH的報道較少，已報道的固定化細胞或酶都存在機械強度低，傳質阻力大，酶活不高等問題，不適于工業化生產。同時上述的很多文獻都提到利用酵母菌的糖酵解系統產生ATP來解決酶法生產的成本問題。但這種耦合體系中ADP的積累往往會抑制GSH合成酶的活性，造成GSH產率低下。

交聯酶聚集體（Cross-linked enzyme aggregates，CLEAs）是一種無需活性載體的加入而直接將不同形式的酶用交聯劑進行交聯進而制得固定化酶的技術。該固定化技術對酶純度要求不高，酶的負載量高，操作簡便，成本低，很有可能發展成為從宏觀角度提高酶選擇性及催化活性的修飾手段，是一種極具開發前景的固定化方法。交聯酶聚集體已經應用于手性化合物拆分［7］、有機合成［8，9］、藥物中間體合成［10］、生物柴油［11］及生物傳感器領域，還可用于醫療蛋白的釋放、化妝品和洗滌劑，工業廢物、污染水的環境治理等。現階段，已經有數十種酶如?；D移酶、葡萄糖異構酶、脂肪酶［12-14］、蛋白酶等的CLEAs已實現商品化。共固定CLEAs（Coimmobilized in CLEAs，combi-CLEAs）是將多個酶聚集在一起，形成多種酶復合的CLEAs，從而實現多步反應一步催化，減少了單元操作數和反應器體積。Mateo［15］將光學選擇性為S型的醇腈酶和無選擇性的腈水解酶共沉淀制備出復合 CLEAs，該復合CLEAs能夠利用苯甲醛和氰化物合成S-扁桃酸。López-Serrano等［16］將7種不同的商業脂肪酶共固定合成一種CLEAs，其酶活相對原始酶提高了超過10倍。Timo等［17］將PepX、PepN兩種X-脯氨酰二肽酰氨肽酶1∶1加入進行CLEAs制備時，兩個酶的酶活均達到最高。Taboada-Puig等［18］將Bjerkandera adusta過氧化物酶（VP）與Bjerkandera adusta（GOD）葡萄糖氧化酶進行共固定制備VP-GOD-CLEAs的酶活回收率為89%，而單獨VP-CLEAs的酶活回收率只有67%，此聯合CLEAs對H2O2表現出更高的耐受性，同時在葡萄糖添加的情況下，VP的酶活更高。Jung［19］將淀粉蔗糖酶AS、麥芽寡糖基海藻糖水解酶（MTS）、糖基海藻糖水解酶（MTH）被共同交聯在一起，制備成聯合CLEAs，進而達到一步生物轉化蔗糖為海藻糖的目的，3種酶的比例分別為 8∶0.5∶0.5（AS 4 mg∶MTS 0.25 mg∶MTH 0.25 mg），此聯合CLEAs在使用5批后酶活無任何損失，但由于其存在不易分離回收的缺點，導致影響其工業化應用及重復使用。

基于以上研究背景，本實驗室通過基因改造手段強化gshA的表達，弱化gshB及ackA的表達，有效解決了產物積累對gshA的酶活抑制，構建了谷胱甘肽合成酶產生菌E.coli-gshA-gshB-ackA。在此基礎上，本研究著重考察此多酶體系的CLEAs的制備及條件優化，旨在解決谷胱甘肽項目雜質及成本問題。

1 材料與方法

1.1 材料

谷胱甘肽合成酶產生菌E.coli-gshA-gshB-ackA（gshA為谷氨酰半胱氨酸合成酶、gshB為谷胱甘肽合成酶、ackA為乙酰磷酸激酶）保藏于浙江海正藥業股份有限公司中央研究院酶工程研究所，菌種編號pEL915，通過基因改造3個酶的表達比例約為10∶3∶1。

PEI-600、PEI-10000、PEI-70000（阿拉丁試劑），BSA（上海生工）、BSA水溶液（thermo公司），50%戊二醛（北京百靈威科技有限公司），（NH4）2SO4、甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、乙酸乙酯、吐溫-20、SDS、TritonX-100、蔗糖、葡糖糖、Lys、D-山梨醇、可溶性淀粉、吐溫-80、瓊脂糖、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O及其他試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶液制備

1.2.1.1 培養基 種子培養基：酵母抽提物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0。發酵培養基：酵母膏4 g/L，蛋白胨8 g/L，甘油10 g/L，KH2PO45 g/L，（NH4）2SO44 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH7.2。

1.2.1.2 酶液制備 將培養后的工程菌915進行10 000 r/min離心收集菌體，-20℃冷凍儲存，根據實驗所需取出適量進行重懸，均質機破碎得到酶液。

1.2.2 沉淀條件研究

1.2.2.1 沉淀劑的選擇 分別選?。∟H4）2SO4、甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、乙酸乙酯共6種沉淀劑進行沉淀，其中，（NH4）2SO4選取30%、40%、50%、60%、70%和80%飽和度對酶液進行沉淀，其余試劑均選用體積比20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%對酶液進行沉淀。

1.2.2.2 沉淀速度對酶活回收率的影響 考察一次性加入和緩慢加入對酶活回收率的影響。

1.2.2.3 沉淀時間對酶活回收率的影響 分別考察不同的沉淀時間（0.5、1、2、4、6、8和17 h）對酶活回收率的影響。

1.2.3 交聯條件的摸索

1.2.3.1 戊二醛濃度對酶活的影響 考察不同戊二醛終濃度（0.1%、0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%和7.5%）對酶活回收率的影響。

1.2.3.2 交聯pH對酶活回收率影響 考察不同交聯pH（5、6、7、8、9、10和11）對酶活回收率的影響。

1.2.3.3 交聯時間長短對酶活的影響 考察不同交聯時間（0.5、1、2、3、4、5、6、7、8和9 h）對酶活回收率的影響。

1.2.3.4 交聯溫度對酶活的影響 考察不同溫度（4℃、15℃、25℃、30℃和37℃）條件下交聯對酶活回收率的影響。

1.2.4 蛋白濃度對酶活回收率的影響 考察不同酶液蛋白濃度（51.07、40.8、30.6、20.4、10.2、5.1和2.5 g/L）及不同戊二醛濃度（0.25%、0.5%、0.75%、1%和1.25%）對CLEAs制備及酶活的影響。

1.2.5 添加劑對CLEAs制備及酶活的影響 考察在戊二醛濃度為0.25%及0.5%時，終濃度為1 g/L的各種添加劑對CLEAs酶活的影響。酶液濃度為30 g/L，先將添加劑加入到破胞酶液中，充分混勻后進行冷室4℃過夜沉淀，隔天進行20℃，220 r/min條件下交聯反應，交聯1 h后取2 mL進行離心收集CLEAs，用0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，最終收集到的CLEAs進行酶活檢測。

1.2.6 酶活力測定 經優化確定轉化體系酶活檢測方法為：在10 mL轉化體系中，各底物濃度分別為半胱甘酸60 mmol/L、甘氨酸180 mmol/L、谷氨酸鈉180 mmol/L、七水氯化鎂40 mmol/L、乙酰磷酸二鋰鹽（ACP）180 mmol/L、ATP 1 mmol/L、磷酸緩沖液（磷酸氫二鉀100 mmol/L）。按上述濃度將半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸鈉、七水氯化鎂、ACP、K2HPO4配置成母液，pH調至7.2，ATP配置200 mmol/L的母液，在100 mL轉化瓶中稱取0.5 g CLEAs或者50 μL蛋白酶液，加入上述母液9.90 mL，混合均勻，30℃恒溫搖床預熱10 min，最后加入50 μL ATP母液，30℃，150 r/min震蕩，開始計時，0.5 h后取樣進行GSH含量檢測。酶活定義：在檢測條件下，每分鐘催化生成 1 mol GSH所需的酶量為 1 U。

1.2.7 CLEAs的收集方法 采用離心法進行CLEAs的收集，收集條件為6 000 r/min離心12 min，0.1 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，最終收集到的CLEAs，4℃冰箱放置備用。

1.2.8 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍法測定。

1.2.9 蛋白質沉淀率測定 蛋白質沉淀率/%=（1 -a1/a2）×100%，式中：a1為固定化后酶液剩余蛋白質含量；a2為固定化前酶液的蛋白質含量。

1.2.10 CLEAs酶活回收率測定 酶活回收率/%=固定化酶酶活力/固定化前游離酶酶活力×100%

1.2.11 CLEAs催化合成GSH

1.2.11.1 使用批次 使用0.5%戊二醛濃度條件下分別添加了BSA及PEI 600為添加劑制備得到的CLEAs連續反應12批次，測定各次轉化反應的酶活力，以第1次反應酶活力為100%，分別計算相對酶活力，同時繼續進行GSH轉化合成實驗，考察最終生成GSH的產量。

1.2.11.2 儲藏穩定性 將制備好的CLEAs儲藏在4℃冰箱中，隔段時間取出進行酶活檢測。

2 結果

2.1 沉淀條件研究

2.1.1 沉淀劑的選擇 硫酸銨對915產酶的沉淀效果影響（圖1）顯示，當硫酸銨為60%飽和度時，蛋白沉淀率為94.9%，酶活回收率為93%，具有較好的酶活回收率及蛋白沉淀率。

圖1 硫酸銨飽和度對915產酶的沉淀效果影響

如圖2所示，各種有機溶劑對915產酶進行沉淀，在有機溶劑體積比為40%以上時，蛋白沉淀率均能達到90%以上，但所有實驗的有機溶劑的酶活回收率均較低，幾乎均在10%以下。因此，對比硫酸銨及各種有機溶劑對蛋白的沉淀效果，最終確定以硫酸銨作為CLEAs制備的蛋白沉淀劑。

2.1.2 沉淀速度對酶活回收率的影響 一次性投入時酶活回收率為77.7%，緩慢投入時酶活回收率為78.4%，二者相差無幾，由此說明以硫酸銨為沉淀劑的蛋白沉淀過程相比用其它有機溶劑為沉淀劑時，沉淀過程相對比較溫和，對酶活的損失較小，硫酸銨投入的速度對酶活影響較小。

2.1.3 沉淀時間長短對酶活回收率的影響 如表1所示，在沉淀時間2 h以內，隨著沉淀時間的延長，酶活回收率逐漸提高，但是2 h以后，沉淀時間長短對酶活回收率的影響較小。

圖2 有機溶劑對915產酶蛋白沉淀率（A）及酶活回收率（B）的影響

表1 沉淀時間對酶活回收率的影響

2.2 交聯條件優化

2.2.1 戊二醛濃度對酶活回收率的影響 如圖3所示，最適的戊二醛濃度為0.25%，此時的酶活回收率為29.68%，隨著戊二醛濃度的進一步增大，CLEAs的酶活呈線性快速下降，至1%濃度時，CLEAs的酶活近乎為0。

2.2.2 交聯pH對酶活回收率的影響 如表2所示，最適的交聯pH為6.0，酶活回收率為45.6%，同時發現在pH6.0-9.0范圍內酶活回收率差別較小。

圖3 戊二醛濃度對酶活回收率的影響

表2 0.25%戊二醛條件下交聯pH對酶活的影響

2.2.3 交聯時間對酶活回收率的影響 結果（圖4）顯示，0.25%和0.5%戊二醛濃度下，交聯時間對酶活影響較小，酶活回收率主要與戊二醛濃度有關。

圖4 0.25%及0.5%戊二醛條件下交聯時間對酶活的影響

2.2.4 交聯溫度對酶活的影響 結果（表3）顯示，較低溫度更利于CLEAs酶活的保留，4℃最適交聯溫度，酶活回收率為46.43%。與此同時發現不同溫度條件下交聯得到的CLEAs顏色有較大差別。

表3 交聯溫度對酶活的影響

2.3 蛋白濃度對酶活回收率的影響

實驗結果（圖5）顯示，在相同交聯劑存在的條件下，較高濃度的酶溶液制備得到的CLEAs的酶活回收率較高，而低濃度酶液即使在很低濃度戊二醛條件下制備的CLEAs的酶活回收率也很低。蛋白濃度在＞20.4 g/L以上時，在0.25%戊二醛濃度條件下交聯得到的CLEAs的酶活回收率在53%以上。由此得出，酶液的蛋白濃度是影響CLEAs酶活的一個非常重要的因素。由于均質破胞時菌懸液濃度不宜過高，故后期選定蛋白濃度為30 g/L的酶液進行CLEAs的后續研究。

圖5 蛋白濃度及戊二醛濃度對CLEAs酶活回收率的影響

2.4 添加劑對酶活回收率的影響

2.4.1 添加劑初篩 如圖6所示，在0.5%戊二醛條件下，對一系列添加劑進行初篩，1 g/L添加劑對CLEAs的酶活有明顯促進作用的是SDS、BSA、Lys及PEI-600。

2.4.2 添加劑復篩 分別在0.25%及0.5%戊二醛濃度條件下，對SDS、BSA、Lys及PEI-600的相對最適濃度進行進一步摸索。結果（圖7）顯示，在0.25%戊二醛濃度條件下，除了PEI（添加劑w∶酶液蛋白w=1∶20）對酶活有相對較明顯的促進作用外，其余添加劑的作用均不明顯；而在0.5%戊二醛條件下，BSA及PEI-600對CLEAs酶活均有很明顯的促進作用，BSA在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶1時對酶活的促進作用最明顯，酶活回收率達到54.2%；PEI 600在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶5時對酶活的促進作用最明顯，酶活回收率達到50.7%。

圖6 各種添加劑對CLEAs酶活的影響（初篩）

在0.25%及0.5%戊二醛條件下，分別繼續對上述復篩結果中各最適添加劑濃度進行進一步驗證。結果（圖8）顯示，在0.25%及0.5%戊二醛條件下，BSA及PEI 600對CLEAs酶活均有很明顯的促進作用。在0.25%戊二醛濃度條件下，BSA在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶120時酶活回收率達到57.7%，單位CLEAs的酶活為5.9 U/g；PEI 600在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶20時酶活回收率達到64.2%，單位CLEAs的酶活為6.1 U/g，分別相比對照組的54%及4.9 U/g提高了3.7%、1 U/g及10.2%、1.2 U/g；在0.5%戊二醛濃度條件下，BSA在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶1時酶活回收率達到50.2%，單位CLEAs的酶活為4.0 U/g；PEI 600在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶5時酶活回收率達到48.2%，單位CLEAs的酶活為4.9 U/g，分別相比對照組的28.7%及2.57 U/g提高了21.5%、1.43 U/g及19.5%、2.33 U/g。

2.5 轉化批次

分別以添加BSA與PEI 600制備得到的CLEAs聚集體進行批次轉化實驗。如圖9-A所示，以BSA為添加劑時，GSH最高產量達10.78 g/L，轉化率為58.6%，在轉化第12批次時GSH產量為7.5 g/L，相對酶活力為69.7%，轉化率為40.8%；如圖9-B所示，在以PEI 600為添加劑時，GSH最高產量達11.26 g/L，轉化率為61.2%，在轉化第12批次時GSH產量為9.03 g/L，相對酶活力為78.4%，轉化率為50.2%。 2.6 儲藏穩定性

圖7 0.25%（A）及0.5%（B）戊二醛條件下添加劑對CLEAs酶活復篩

考察了在0.5%戊二醛條件下，添加了PEI 600（添加劑w∶酶液蛋白w=1∶5）制備得到的CLEAs在4℃條件下的儲藏穩定性。結果（圖10）顯示，在儲藏33 d時間內，CLEAs催化GSH合成時，GSH的產量最大達到了12.1 g/L，轉化率為65.9%，儲藏33 d以后，GSH的產量為10.56 g/L，轉化率為57.4%，具有良好的儲藏穩定性。

3 討論

在交聯酶聚集體的制備中，酶聚集體的形成是保持酶活性最關鍵的步驟。聚集體中酶分子之間以次級鍵相互作用，在水溶液中會出現解聚。酶聚集體的活性大小、緊密程度、均勻性等特性都可通過選擇不同的沉淀劑、控制沉淀劑的濃度、添加速度、攪拌速度及溶液系統的體積大小、溶液的pH、溫度等來調節。Schoevaart等［20］采用14種沉淀劑對12種脂肪酶酶蛋白進行沉淀，發現不同的沉淀劑對同一種酶的沉淀效果差異顯著，其提出酶的沉淀過程存在著酶分子聚集與變性的競爭。Dong等［21］也提出高沉淀劑濃度導致聚集成為主導，而低沉淀劑濃度則導致變性成為主導。本研究選取了硫酸銨、甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、乙酸乙酯6種文獻普遍報道的沉淀劑對谷胱甘肽合成酶系進行沉淀，結果發現，當硫酸銨濃度達到60%飽和度時，蛋白沉淀率為94.9%，酶活回收率為93%，具有較好的酶活回收率及蛋白沉淀率，而其他幾種沉淀劑雖然隨著濃度的增加，酶活沉淀率幾乎趨近于100%，但是酶活損失巨大，幾乎都只有10%左右的酶活殘留率。與此同時，我們也考察了硫酸銨的加入方式及沉淀時間的長短，結果發現整個沉淀過程對酶活的損失較小，甚至硫酸銨對酶活還起到了一定的保護作用，因為之前有實驗發現均質處理過的酶液在4℃條件下極易失活，而以硫酸銨沉淀處理后的酶液在較長時間仍存在較高的酶活，酶活回收率較高。

圖8 0.25%（A）及0.5%（B）戊二醛條件下添加劑對CLEAs酶活復篩

圖9 轉化批次考察

圖10 儲藏穩定性考察

交聯步驟是制備出高活性及高穩定性的交聯酶聚集體的關鍵步驟。Cabiro等［22］在制備Linum usitatissimum的交聯酶聚集體時，發現在使用硫酸銨作為沉淀劑時，沉淀后活性保留80%以上，然而當交聯之后，只保留其游離酶活性的20%，由此可見交聯步驟對酶活的損失之大。常用作交聯劑的有甲醛、乙醛、戊二醛、葡聚糖多醛、環氧基交聯劑、戊二醛結構類似物（二甘醇、高碘酸氧化的糖類［23］），本研究選取通用的戊二醛作為交聯劑，結果發現當戊二醛濃度為0.25%時，此時50 mL酶液收集到的CLEAs的濕重只有11.69 g，酶活回收率為29.68%達到最高，隨著戊二醛濃度的逐步提高，收集到的CLEAs的濕重逐步增加，但是總的酶活回收率反而迅速下降。這可能是由于戊二醛濃度過低導致交聯不充分，未交聯的聚集酶在后續洗滌過程中因為復溶而流失，同時酶固定的不夠牢固，導致最終收集到的CLEAs濕重較低，而戊二醛濃度過高又導致與酶活性相關的胺基也發生交聯，損害了CLEAs的活性，同時使得形成的CLEAs結構更加緊密，增加了傳質阻力，從而降低了CLEAs的表觀酶活力。在此次實驗中，雖然戊二醛濃度在0.25%時，酶活回收率達到最大，但是可能由于交聯不充分，導致交聯酶顆粒很小，過濾收集的方式導致CLEAs的回收十分困難。因此在后續考察添加劑使用時，均在0.25%及0.5%戊二醛濃度條件下同時進行。另外，本研究也考察了交聯溫度對CLEAs酶活回收率的影響，結果發現較低的溫度更有利于CLEAs酶活的保留，4℃是最適的交聯溫度，其酶活回收率為46.43%，與江南大學楊緒娥［24］、北京大學張晶晶等［25］發現在交聯過程中，溫度是影響CLEAs制備的重要因素，隨溫度升高，相對酶活力逐漸降低的報道一致。

許多文獻報道，酶與非離子聚合物、蛋白添加劑、底物類似物等共沉淀能增加酶穩定性，或者提高酶活力。這可能是由于它們能誘導酶分子處于活性狀態，然后這種狀態被隨后的操作“固定”下來；也有可能是它們一直保護著酶蛋白的三級結構；或者是提供更多的氨基與戊二醛進行交聯反應，特別是對于目的蛋白中所含賴氨酸殘基比例較少的酶的CLEAs的制備具有非常明顯的效果。在之前交聯實驗過程中，我們發現使用0.25%終濃度的戊二醛得到的CLEAs的酶活回收率只有29.68%，而我們的酶系中包含3種酶，是以3種酶共同參與反應生成的終產物GSH進行的酶活計算，由此，只要其中一種酶或幾種酶對戊二醛非常敏感，極易與戊二醛反應導致酶失活，從而使得最終的酶活回收率很低，對此我們考察在CLEAs制備過程中加入添加劑等方式來對目的蛋白進行一定程度的保護作用。Hormigo等［26］添加BSA制備了聚-3-羥基丁酸酯（PHB）解聚酶的CLEAs，PhaZSex-CLEAs的尺寸平均為50-300 μm，在重復使用20批后，酶活均沒有損失，表現出更好的溫度及pH穩定性，具有更高的有機溶劑耐受性。Tükel等［27］添加了BSA的過氧化氫酶CLEAs的熱穩定性及儲藏穩定性均優于游離酶，同時在連續使用400批后，其仍保留50%的酶活。Vaidya等［28］將L-氨基?；概cPEI共固定制備的CLEAs（AP-CLEA），其酶活及穩定性較未加均有所提高。Saxena等［29］在制備交聯嗜熱絨毛菌聚集體的過程中添加SDS及TritonX-100，活性均得到了不同程度的提高。天津大學王夢凡等［30］制備Thermomyces lanuginosa脂肪酶CLEAs時沉淀過程添加了SDS，酶活提高2倍，青霉素-G-?；D移酶制備CLEAs時加入葡萄糖、蔗糖及海藻糖，其酶活要高于沒有使用糖作為穩定劑的，同時具有更高的熱穩定性［31］。江南大學的楊雪等［32］在制備Lipozyme CLEAs的過程中添加D-山梨醇與PEG600共沉淀，得到的CLEAs具有較高的催化活性。本研究選取了大量的添加劑進行考察，結果發現在0.5%戊二醛條件下，PEI 600及BSA對CLEAs保持較高酶活及酶活回收率具有明顯的促進作用，BSA 在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶1時酶活回收率達到50.2%，單位CLEAs的酶活為4.0 U/g；PEI 600在添加劑w∶酶液蛋白w=1∶5時酶活回收率達到48.2%，單位CLEAs的酶活為4.9 U/g，分別相比對照組的28.7%及2.57 U/g提高了21.5%，1.43 U/g及19.5%、2.33 U/g。由于添加PEI 600后單位CLEAs的酶活明顯高于未添加及添加了BSA的，最終選取PEI 600（添加劑w∶酶液蛋白w=1∶5）為最適的添加劑。

最后也對制備得到的CLEAs的酶活穩定性及使用批次進行了考察，在4℃條件下放置33 d后，GSH的產量為10.56 g/L，相對酶活力為92.12%，同時在反應12批次后，其酶活仍保留78.4%。但是目前應用仍受到很大局限，CLEAs的顆粒尺寸是影響其工業化應用的一個非常關鍵的因素。文獻報道CLEAs的顆粒尺寸通常是小于10 μm［33，34］，粒徑這個關鍵因素可能在一定程度上限制了其在非均相化合物反應中的分離。除了離心和過濾外，很難從反應體系中將CLEAs分離及回收，而離心或過濾常?？赡軐е翪LEAs凝結成塊，不易再次均勻分散在反應體系中，造成利用效率低下。目前有許多關于避免CLEAs顆粒尺寸小的弊端的新方法報道，如與載體連用［35］，使用氨基功能磁性納米粒子［36-38］等，后期我們也將重點根據工業化生產需求改造CLEAs的顆粒尺寸。

4 結論

通過優化沉淀條件，交聯條件，蛋白濃度及添加劑的使用，最終得到最優的制備方法為：在4℃，30 g/L蛋白濃度條件下，加入PEI-600（添加劑w∶酶液蛋白w=1∶5）與酶液進行充分混合，然后加入60%飽和度硫酸銨沉淀4 h，最后以0.5%戊二醛進行交聯。最終蛋白沉淀率為94.9%，酶活回收率為48.2%，單位CLEAs的酶活為4.9 U/g，分別相比對照組的28.7%及2.57 U/g提高了19.5%、2.33 U/g，GSH最高產量達到11.26 g/L，轉化率為61.2%，在轉化第12批次時GSH產量為9.03 g/L，相對酶活力為78.4%，4℃條件下儲藏33 d后相對酶活力為92.12%。

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（責任編輯 李楠）

Preparation of Crosslinked Enzyme Aggregates of Glutathione Synthetases and Its Application

TIAN Hui YANG Feng-chen LU Hong-yu XU Qi YANG Yong
（Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co.，Ltd.，Taizhou 318000）

In order to reduce the cost in synthesis of glutathione（GSH），and concurrently to realize the enzyme storage and the commercialization，the glutathione synthetase was precipitated through appropriate precipitant，and immobilized crosslinked enzyme aggregates（CLEAs）were prepared by glutaraldehyde crosslinking. By optimizing the precipitation and crosslinking conditions，as well as the uses of protein concentration and additives，finally the optimal preparation condition was determined as：4℃，30 g/L protein concentration，adding PEI-600（additive W∶enzyme protein w = 1∶5）fully mixed with the enzyme solution，then 60% saturated ammonium sulfate added for precipitation for 4 h，and finally crosslinked by 0.5% glutaraldehyde. The final protein precipitation rate was 94.9% and the recovery of enzyme activity was 48.2%，enzyme activity per CLEAs was 4.9 U/g，respectively，compared to the control group 28.7% and 2.57 U/g，and increased by 19.5% and 2.33 U/g. The highest yield of GSH reached 11.26 g/L，GSH yield was 9.03 g/L in the 12th batches of conversion，and the relative enzyme activity was 78.4%；after 33 d storage at 4℃，the relative enzyme activity remained 92.12%. In conclusion，after optimizing the preparation conditions，the CLEAs of glutathione synthetases presented higher initial enzyme activity，which could be stably converted more than 10 batches，with favorable storage stability and solid industrialization prospects.

glutathione synthetases；immobilization；crosslinked enzyme aggregates；additives

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.034

2016-01-29

田慧，女，碩士研究生，研究方向：酶制劑與酶催化；E-mail：tianhui@hisunpharm.com

楊勇，男，博士研究生，研究方向：分子生物學與酶催化；E-mail：yyang@hisunpharm.com