低溫木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷酶AX543的基因克隆及性質研究

張明慧 李中媛 仇海燕 王翠瓊 王惠 張同存

（天津科技大學生物工程學院 工業微生物重點實驗室，天津 300457）

低溫木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷酶AX543的基因克隆及性質研究

張明慧 李中媛 仇海燕 王翠瓊 王惠 張同存

（天津科技大學生物工程學院 工業微生物重點實驗室，天津 300457）

旨在獲得在低溫條件下具有高催化能力的低溫木糖苷酶，并對其進行異源表達研究和酶學性質分析。利用Touch down PCR和TAIL PCR方法，從枝頂孢菌中克隆得到一個序列新穎的GH43家族雙功能木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶基因ax543，該酶基因在畢赤酵母中成功表達。酶學性質分析發現重組酶AX543的最適溫度為25℃，在15℃和4℃仍有54%和21%的相對酶活；具有木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶活性，并可以降解木二糖、木三糖、樺木木聚糖、櫸木木聚糖和小麥阿拉伯木聚糖；可以與木聚糖酶Xyn11-1協同作用，協同度達1.46；具有高木糖/阿拉伯糖耐受性，抑制常數Ki分別為84.78 mmol/L和54.01 mmol/L。

木糖苷酶；阿拉伯呋喃糖苷酶；雙功能；低溫；協同作用；產物耐受性

木聚糖是一類由β-1，4-糖苷鍵連接木糖單元形成主鏈，而主鏈又被不同基團修飾的異質多糖［1］。木聚糖是半纖維素的主要組成成分，在植物細胞壁中的含量僅次于纖維素。由于其結構的復雜性，木聚糖的完全降解需要多種糖苷水解酶的協同作用，其中木聚糖酶首先作用于木聚糖主鏈將其降解為低聚木糖，隨后β-木糖苷酶進一步將低聚木糖降解為木糖，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶負責水解其側鏈的取代基［2］。β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶是木聚糖降解酶系中的關鍵酶，近年來人們發現了一類雙功能木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶，它們可以同時降解多種底物，從而減少酶的用量，降低生產成本，而且能夠與木聚糖酶協同降解木聚糖，提高還原糖的生成量，解除低聚木糖對木聚糖酶的反饋抑制作用［3］。

β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶被廣泛應用于食品、生物轉化和造紙行業等工業［4-6］，但是在實際應用中面臨著一個比較突出的問題：為了減少食品中活性成分、風味物質和營養成分的損失，一些如葡萄酒發酵和果汁澄清等食品加工過程通常需要在低溫條件下進行（＜30℃）［7］，但當前工業應用的木糖苷酶都屬于中高溫酶（40-60℃），它們在低溫條件下（0-20℃）的活力很低甚至完全喪失［8，9］，如果不解決木糖苷酶在低溫條件下活力低的問題，將嚴重限制其在食品加工及其他需要低溫處理工業中的應用。

具有嗜冷特性的低溫酶為解決這一問題提供了一個新思路，低溫酶的最適溫度一般在30℃以下，在低溫條件下仍具有較高的催化活性；而且低溫酶在中高溫條件下熱穩定性差，只用溫和的熱處理就可終止催化反應，從而減少加熱和冷卻過程，降低生產成本［10］。但是目前有基因序列和酶學性質研究報道的低溫木糖苷酶極少，所以亟需發掘具有低溫特性的木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶。本研究從大興安嶺多年凍土中的枝頂孢屬菌Acremonium sp. WCQ6A中克隆得到一個新的GH43家族低溫木糖苷酶基因AX543，對該基因在畢赤酵母中進行表達，并對其酶學性質進行系統的研究，以期開發具有低溫應用食品工業及其他需要低溫處理的工業潛力的酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 枝頂孢菌Acremonium sp. WCQ-6A是本實驗室前期從大興安嶺多年凍土分離得到，已保藏于中國普通微生物菌種保藏中心（CGMCC），菌種保藏號為CGMCC11804。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、Pichiapastoris GS115和pPIC9質粒由本實驗室保存；pMD19-T購自寶生物工程（大連）股份有限公司。

1.1.2 試劑 LA Taq購自TaKaRa公司；限制性內切酶EcoRⅠ、NotⅠ和PmeⅠ購于Fermentas公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、質粒小提試劑盒和DNA純化試劑盒購自北京索萊寶公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Scientific公司。底物對硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷（pNPA）、對硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷（pNPX）、櫸木木聚糖、樺木木聚糖和小麥阿拉伯木聚糖均購自Sigma公司；其他化學試劑購于天津市江天化工技術有限公司，均為分析純。

1.1.3 培養基 YPD培養基：1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖；BMGY培養基：1%酵母浸出物、2%蛋白胨、1%甘油；BMMY培養基：1%酵母浸出物、2%蛋白胨；NB培養基：0.3%酵母浸出物、0.5%蛋白胨、0.6%葡萄糖、1% NaCl。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 將枝頂孢菌WCQ6A在NB培養基中30℃條件下培養48 h后收集菌體，立即加入液氮，反復研磨破碎菌體，并用CTAB-SDS法提取基因組DNA［11］。

1.2.2 雙功能酶AX543基因序列的克隆與分析 以枝頂孢菌WCQ6A基因組DNA為模板，根據GH43家族木糖苷酶基因的保守區序列設計簡并引物XylDF和XylDR（表1），利用Touchdown PCR克隆AX543保守區序列［12］，擴增程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，65-55℃ 45 s，72℃ 1 min（每個循環降0.5℃）；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，共30個循環；72℃ 10 min。將擴增得到的大小約600 bp的基因片段純化后，連接pMD19-T載體，進行測序。根據測序正確的保守區序列分別設計上游和下游的特異性嵌套引物，通過Tail-PCR獲取側翼基因序列［11］，通過Vector NTI 7.0（Invitrogen）拼接獲取全長，通過BlastX和BlastP（http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）比對分析基因序列。

利用SignalP 4.0軟件分析其信號肽切割位點（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）； 利用NetNGlyc 1.0 sever和NetOGlyc 4.0 sever軟件預測蛋白的N-糖基化位點和O-糖基化位點（http://www. cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/；http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）；利 用FGENESH 軟 件 預測內含子信息（http://linux1.softberry.com/）；利用ClustalW軟件進行多序列比對分析（http://www.ebi. ac.uk/clustalW）；利用Vector NTI7.0軟件預測蛋白分子量和等電點。

表1 本研究所用到的引物

1.2.3 雙功能酶基因AX543在畢赤酵母中的表達及重組蛋白的純化 表達載體的構建：以Acremonium sp. WCQ6A基因組DNA為模板（基因無內含子），根據AX543基因序列設計帶有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點的擴增引物AX543F和AX543R（表1中下劃線部分），為了方便后續純化，在蛋白C-端引入His標簽，PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min 10 s，30個循環；72℃ 10 min。將雙酶切后的PCR產物與pPIC9載體連接，構建重組表達質粒pPIC9-ax543，轉化大腸桿菌，測序正確后備用。

重組菌株pPIC9-ax543-GS115的獲得和高酶活菌株的篩選：提取表達質粒用限制性內切酶PmeⅠ線性化后電轉入畢赤酵母GS115感受態細胞中，涂布于MD平板，30℃培養2-3 d；待長出His+菌落后，挑取單克隆到3 mL BMGY培養基中，30℃培養48 h后5 000 r/min離心5 min去上清，加入1 mL BMMY培養基（0.5% V/V甲醇）進行誘導；誘導結束后，離心獲得上清，測定木糖苷酶酶活。將篩選獲得的酶活最高的轉化子進行搖瓶發酵培養，先在400 mL BMGY中培養36 h后，12 000 r/min離心5 min去上清，然后用200 mL BMMY培養基進行甲醇誘導（甲醇初始濃度0.5 mL/100 mL培養基），每24 h補加0.5 mL/100 mL培養基的甲醇進行持續誘導，96 h后離心收集上清，用于后續蛋白純化和酶學性質測定。

重組蛋白的純化：重組蛋白AX543用鎳親和層析進行純化，用含不同濃度梯度咪唑（10-300 mmol/L） 的 緩 沖 液（20 mmol/L Tris，50 mmol/L NaCl，pH8.0）洗脫目的蛋白，收集不同濃度梯度的洗脫液進行SDS-PAGE蛋白電泳檢測純度，并通過BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度的測定。

1.2.4 重組雙功能酶酶學性質分析

1.2.4.1 酶的最適溫度、熱穩定性、最適反應pH值和pH穩定性測定 （1）最適溫度測定：在pH6.0的條件下，測定純化后的酶在不同溫度下（0℃-50℃）的酶活。（2）熱穩定性測定：將重組酶分別在40℃、50℃和60℃處理60 min，并在不同時間點取樣（0、1、2、5、10、20、30和60 min），在25℃和pH6.0條件下測定剩余酶活。（3）最適pH測定：測定純化后的酶在pH3.0-11.0條件下的酶活，緩沖液如下：0.2 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸pH3.0-8.0；0.2 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH8.0-11.0，25℃反應10 min。（4）pH穩定性測定：將純化后的酶先用不同pH的緩沖液稀釋，37℃處理1 h，再用最適pH的緩沖液再進行一定稀釋，在25℃和pH6.0條件下測定剩余酶活。每個實驗重復測定3次。

1.2.4.2 金屬離子及化學試劑對酶活性的影響 在反應體系中加入終濃度為5 mmol/L的不同金屬離子及化學試劑，在25℃和pH6.0的條件下測定酶活性［13］。以只加入對應的金屬離子、化學試劑而不加入酶液作為對照。每個實驗重復測定3次。

1.2.4.3 底物特異性 分別以1%櫸木木聚糖、樺木木聚糖、小麥阿拉伯木聚糖為底物，在25℃，pH6.0的條件下測定酶活性。

1.2.4.4 比活力和動力學參數的測定 1個酶活性單位（U）定義為在最適反應條件下，每分鐘分解底物pNPX或者pNPA生成1 μmoL對硝基酚（pNP）所需的酶量。在pH6.0，25℃條件下測得重組酶AX543的木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶活性，同時采用BCA法測定純化后AX543的蛋白濃度，每個實驗重復測定3次，最終計算出每毫克蛋白所含的酶活力單位，即酶的比活力。配制不同濃度的pNPX和pNPA（0.4-2 mmol/L），在25℃和pH6.0條件下測定酶活性，利用米氏方程雙倒數法（Lineweaver-Burk）作圖并繪制曲線，求出Km值和Vmax。

1.2.4.5 木糖耐受性和阿拉伯糖耐受性的測定 配制2 mmol/L和3 mmol/L的底物pNPX和pNPA，向反應體系中加入0-400 mmol/L不同濃度的木糖/阿拉伯糖，在最適反應條件25℃和pH6.0測定酶活并分別計算其Ki值。

1.2.5 薄層色譜（TLC）水解產物分析 在100 μL的1%（W/V）櫸木木聚糖中加入6 U純化后的酶液，25℃、pH6.0條件下分別反應0.5、1、2、4、8和12 h；在50 μL木二糖和木三糖（5 mg/mL）底物中加入2 U純化后酶液在25℃、pH6.0條件下反應1 h；將上述反應體系于沸水中煮沸5 min后，12 000 r/min離心5 min，取上清點樣于硅膠板G-254，在展開劑［正丁醇∶水∶乙酸（V∶V∶V）=2∶1∶1］中展開兩次，展開后置于顯色劑（丙酮∶二苯胺∶苯胺∶磷酸=50 mL∶1 g∶1 mL∶5 mL）中浸泡數秒后立即于90℃烘箱烘干顯色。

1.2.6 雙功能酶AX543與木聚糖酶Xyn11-1的協同作用 在900 μL的0.5%（W/V）櫸木木聚糖中加入100 μL酶液（0.5 U AX543/0.5 U Xyn11-1）。第一步反應在pH6.0、30℃條件下進行，6 h后置于100℃沸水中煮沸10 min終止反應；接著進行第二步反應（6 h），反應結束后通過DNS法測定酶活并計算協同效率［11］。協同效率的定義為協同反應產生的總還原糖與各單酶反應產生總還原糖總和的比值［13］。每個實驗重復測定3次。

2 結果

2.1 雙功能酶AX543基因序列的克隆與分析

通過Touch-down PCR及Tail-PCR分別擴增出一條長622 bp的保守區序列，以保守區序列為模板，通過Tail-PCR擴增得到了AX543的編碼基因，為975 bp，編碼324個氨基酸和一個終止密碼子，無糖基化位點、信號肽和內含子。預測其成熟蛋白分子量為41.8 kD，等電點為4.99。BlastP比對結果顯示AX543屬于GH43家族，與來源于Acremenium chrysogenum的木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶的一致性為86%；來源菌環帶狀枝頂孢菌WCQ6A的ITS和基因ax543序列已提交至NCBI數據庫，其檢索號分別為（KU376503）和（KU353562）。結合多序列比對分析和已報道的GH43家族木糖苷酶的晶體結構分析［14］，找到了AX543存在有3個保守的催化位點（圖1），Asp12和Glu225為酸堿催化殘基，Asp131參與調節催化氨基酸的pKa和底物與催化氨基酸的定位。

2.2 雙功能酶基因AX543在畢赤酵母中的表達與重組蛋白純化

將篩選得到酶活力最高的7#轉化子于1 L搖瓶發酵培養以確定最佳誘導時間，結果（圖2-A）顯示在誘導96 h時AX543的酶活力達到最高；將發酵液上清用鎳親和柱純化，其中200 mmol/L洗脫液中的酶活最高，純化后的蛋白大小約為42 kD，與理論值相符（圖2-B）。

2.3 雙功能酶AX543的酶學性質分析

AX543的最適溫度為25℃，在15℃、4℃和0℃時，以pNPX為底物時的相對酶活分別為53.61%、20.57%和6.28%，以pNPA為底物時的相對酶活較低，分別為38.44%、14.04%和4.15%（圖3-A）；該酶的熱穩定較差，其木糖苷酶活性/阿拉伯呋喃糖苷酶活性在40℃處理1 h后的剩余酶活為50%，但在50℃處理5 min后酶活全部喪失（圖3-B）；AX543的最適pH為6.0（圖3-C），在pH5.5-7.0范圍內，其木糖苷酶活性高于阿拉伯呋喃糖苷酶活性，pH穩定性結果表明，以pNPA為底物時在pH5.0-9.0范圍內較穩定（圖3-D）。

金屬離子及化學試劑試驗表明，Mn2+、Ca2+和β-巰基乙醇對該酶的激活作用十分顯著，為114.9%-344.0%；此外，乙醇能激活其木糖苷酶活性至206.5%，但是卻抑制其阿拉伯呋喃糖苷酶活性至96.1%（表2）。木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶AX543的比活分別為4.99 U/mg和1.16 U/mg，動力學常數Km、Vmax和Kcat分別為5.94 mmol/L、3.53 μmol/（min·mg）、2.46 s-1和 14.29 mmol/L、3.23μmol/（min·mg）、2.25 s-1；AX543對櫸木木聚糖、樺木木聚糖和小麥阿拉伯木聚糖均有降解作用，在以上3種聚糖為底物時的比活分別為17.95 U/mg、10.35 U/mg和1.19 U/mg。

圖1 AX543多序列比對

圖2 重組蛋白AX543的誘導表達條件優化（A）和純化（B）

圖3 溫度（A和B）及pH（C和D）對AX543的影響

表2 不同金屬離子對酶活性分析

2.4 AX543的木糖耐受性和阿拉伯糖耐受性

以不同濃度梯度的木糖和阿拉伯糖作為抑制劑， 以2 mmol/L和3 mmol/L的pNPX和pNPA為底物測定AX543對木糖和阿拉伯糖的耐受性，計算得AX543的Ki值分別為84.78 mmoL/L和45.01 mmoL/L。

2.5 TLC水解產物分析

TLC水解產物結果（圖4）表明，AX543處理櫸木木聚糖0.5、1、2、4、8和12 h后的降解產物都是木糖，同時AX543可以將木二糖和木三糖水解生成木糖。

2.6 AX543與木聚糖酶Xyn11-1的協同作用

協同作用實驗中，當先加入木聚糖酶Xyn11-1［15］后再加入雙功能酶AX543時，還原糖的釋放量比單獨加入這兩種酶時提高了1.2倍；同時加入Xyn11-1和AX543時的協同率最高，為1.46倍；但先加入AX543后再加入Xyn11-1則會抑制櫸木木聚糖的降解（表3）。

圖 4 TLC水解產物分析

表3 AX543與Xyn11-1的協同作用

3 討論

低溫酶可以在低溫下具有較高的催化活性，可以克服中高溫酶在低溫條件下活性低下的缺點，在食品及其它需要低溫處理的工業中具有巨大的應用潛力。目前發現的大多數木糖苷酶的最適溫度在40-60℃之間，具有低溫特性木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶非常少，只有P. herquei IFO4674來源的S2a、A. oryzae來 源 的XylB和Fusarium graminearum［16］來源的XyloA 屬于低溫木糖苷酶，其最適溫度都是30℃。本研究從大興安嶺多年凍土來源的枝頂孢菌WCQ6A中獲得了一個低溫的GH43家族木糖苷酶AX543，與其他低溫木糖苷酶相比，AX543的最適溫度更低（25℃），更加接近于室溫條件，是目前報道的最適溫度最低的木糖苷酶，在低溫工業應用中具有很好的潛力。

一種酶具有多種底物活性可以擴展其應用范圍，但是目前發現的一些木糖苷酶只能降解一種底物，如來源于P. herquei和A. oryzae中的兩個低溫木糖苷酶只能水解糖苷酶pNPX；一些木糖苷酶可以降解少數幾種底物，如來源于Enterobacter sp.的木糖苷酶Xyl43只可以降解pNPX和木二糖［17］；來源于Phanerochaete chrysosporium的PcXyl可作用于pNPX和pNPA但不能降解木聚糖［18］。本研究的AX543具有廣泛的底物特異性，能夠作用于pNPX、pNPA、樺木木聚糖、櫸木木聚糖、小麥阿拉伯木聚糖、木二糖和木三糖，而且降解物終產物都為木糖。

研究發現一些木糖苷酶可以與木聚糖酶一起協同作用水解木聚糖，這種特性可以大大提高木糖產量，從而降低生產成本［13］。本研究的木糖苷酶AX543可以與木聚糖酶Xyn11-1協同催化櫸木木聚糖，其作用協同率高于Humicola insolens來源的Xyl43A（1.29倍），但是要低于Alicyclobacillus sp. A4來源的雙功能酶Ac-Abf51A（2.92倍）。同時我們還發現木糖苷酶AX543和木聚糖酶同時加入時的協同率要高于先加木聚糖酶Xyn11-1后再加木糖苷酶AX543的協同率，這種現象與來源于Alicyclobacillus sp. A4的雙功能酶Ac-Abf51A相似［19］，其潛在原因可能是兩種酶同時作用于木聚糖底物時，木糖苷酶可以與低聚木糖結合，減少低聚木糖對木聚糖酶的抑制作用，從而使木聚糖酶更好地發揮催化作用［20］。此外，我們還發現先加木糖苷酶AX543再加木聚糖酶Xyn11-1時會抑制木聚糖酶本身的降解能力，木糖苷酶Xyl43A與木聚糖酶協同作用時也發現了這種現象［13］，其原因可能是先加入的木糖苷酶占據了木聚糖底物中的酶結合位點，從而導致后續加入的木聚糖酶不能與木聚糖底物結合，不能進一步作用于木聚糖的主鏈產生木糖。

木糖是木糖苷酶降解木聚糖和低聚木糖的產物，同時也是木糖苷酶的抑制劑，在實際生產過程中提高酶的木糖耐受性將會在很大程度上解除酶的抑制作用，提高酶的催化能力，節約成本。目前發現的大多數木糖苷酶的木糖耐受性能力都較差，如來源于Trichoderma reesei、Humicola grisea var. thermoidea和Aureobasidium pullulans的木糖苷酶的Ki值都在2-10 mmol/L之間［21］。AX543具有較好的木糖耐受性（Ki=84.78 mmol/L），這與來源于 Humicola insolens的 Xyl43A（Ki=79 mmol/L）［13］相似，低于T. thermarum來源的xynB3（Ki=1 000mmol/L）［22］；此外AX543對阿拉伯糖耐受性也很高，高于Penicillium purpurogenum來源的阿拉伯呋喃糖苷酶/木糖苷酶XYL1（Ki=2.5 mmol/L）［14］以及雙功能酶deAX（Ki=18.5 mmol/L）［23］。

4 結論

本研究從枝頂孢菌中得到一個新的雙功能木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶基因ax543，并在畢赤酵母中進行了異源表達和高效制備。AX543是目前報道的最適反應溫度最低的雙功能木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷酶，并具有較為廣泛的底物特異性，較高的木糖耐受性和阿拉伯糖耐受性，還可以與木聚糖酶協同作用高效降解木聚糖，這些催化特性使雙功能木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶AX543具有應用于食品工業及其他需要低溫處理工業的潛力。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Characterization of a Novel Cold-active Bifunctional Xylosidase/Arabinfuranosidease AX543

ZHANG Ming-hui LI Zhong-yuan QIU Hai-yan WANG Cui-qiong WANG Hui ZHANG Tong-cun
（Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education and Tianjin City，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457）

This work aims to obtain the cold-active xylosidase with high catalytic activity at low temperature，and to study its heterologous expression，as well as analyze its enzymatic characteristics. A novel psychrophilic bifunctional xylosidase/arabinofuranosidase gene ax543 in GH43 family was cloned using Touch down PCR and TAIL PCR，and was successfully expressed in Pichia pastoris. Analysis of biochemical characterization suggested that recombinant enzyme AX543 exhibited optimal activity at 25℃，and remained 54% and 21% relative activities at 15℃ and 4℃. Moreover，AX543 with xylosidase and arabinofuranosidase activity hydrolyzed xylobiose，xylotriose，birchwood xylan，beechwood xylan，and wheat arabinoxylan，and showed a 1.46 fold synergic effect with xylanase Xyn11-1. AX543 also presented xylose and arabinose tolerance with Ki84.78 mmol/L and 54.01 mmol/L.

xylosidase；arabinofuranosidase；bifunctional；cold-active；synergic effect；product tolerance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.025

2016-03-08

天津市高等學校科技發展基金計劃項目（20140604），天津科技大學青年教師創新基金項目（2014CXLG06）

張明慧，女，碩士，研究方向：微生物與生化藥學，E-mail：zmh415751532@126.com；李中媛同為本文第一作者

張同存，男，博士，教授，研究方向：微生物與生化藥學；E-mail：tony@tust.edu.cn