納米硒抗胰島β細胞凋亡作用與機制的研究

饒磊饒敏仇紅紅李紅輝劉靜莊滿嬌

（1. 成都醫學院生物醫學系，成都 610500；2. 蚌埠94565部隊衛生隊，蚌埠 233000；3. 廣州大學生命科學學院，廣州 510006）

納米硒抗胰島β細胞凋亡作用與機制的研究

饒磊1饒敏2仇紅紅1李紅輝1劉靜1莊滿嬌3

（1. 成都醫學院生物醫學系，成都 610500；2. 蚌埠94565部隊衛生隊，蚌埠 233000；3. 廣州大學生命科學學院，廣州 510006）

旨在研究納米硒（SeNPs）抗二型糖尿病胰島β細胞凋亡的作用及機制。通過電子顯微鏡，納米粒度儀等技術方法對SeNPs的表征進行鑒定，并運用相關分子生物學技術驗證其對于胰島β細胞凋亡模型的保護作用及機制。結果表明，殼聚糖（CS）修飾后的SeNPs表面電荷增加到24.8 mv，其保存期延長到100 d以上。另外，細胞學實驗表明濃度在2 μmol/L以下SeNPs不具有毒性，38.1 nmol/L SeNPs可通過激活硫氧還蛋白還原酶（TrxR）活性，從而減輕胞內氧化應激（ROS）水平，最終使胰島β凋亡模型細胞存活率提高了31.75%。動物學實驗也表明SeNPs能抗胰島β細胞凋亡。因此，SeNPs可有效減輕二型糖尿病中胰島β細胞凋亡，對于二型糖尿病具有潛在的治療價值。

納米硒；二型糖尿病；氧化應激；分子機制

糖尿病是一種常見的內分泌代謝疾病，根據世界衛生組織預測，至2030年時，全球糖尿病患者人數會高達3億6千多萬，其中主要為二型糖尿病（T2DM）患者［1］。我國的糖尿病發病率雖低于某些發達國家，但由于人口基數大，糖尿病患者的人數卻居世界之首。因此開發糖尿病相關藥物與醫療技術具有重要市場價值與臨床意義。

硒是一種重要的礦物質，在改善人類健康狀況扮演重要角色［2］。過去，硒多以有機硒的形式作為營養補充劑，輔助治療癌癥。硒本身具有良好的抗氧化作用，是一種良好的癌癥治療劑［3，4］，然而硒酸鹽的有效治療濃度與毒性的界限接近，劑量難以把握［5］。應用納米技術制造的納米硒（SeNPs），不僅低毒，有較好的生物相容性，還保持了硒抗氧化、抗菌、抗癌、增強免疫力等作用［6-8］。

多項研究表明糖尿病人血液硒含量較正常人低［9，10］，補硒成為治療糖尿病的可能選項，但由于毒性問題，在藥物開發上進展緩慢。隨著對糖尿病發病機理的深入研究，發現氧化應激造成的胰島β細胞凋亡是二型糖尿病逐年加重的主要病因。適當的補充硒，可加強含硒蛋白的活性［11］，如硫氧還蛋白還原酶，其活性的加強可顯著降低細胞內的氧化應激（ROS）水平，從而減輕細胞凋亡。另外，無機硒酸鹽也可直接激活細胞內的硫氧還蛋白還原酶（TrxR），減低細胞內ROS水平［12］。制備的SeNPs雖然降低了毒性，但SeNPs表面電荷接近零價態，零價態的納米顆粒很不穩定，容易聚集沉淀［13］。殼聚糖（CS）是一種有效、具有良好緩釋性能、生物相容性、生物降解性和抗酶活性的有機多糖［14］，已被用來穩定SeNPs。CS修飾SeNPs（CS-SeNPs），表面帶有大量正電荷，穩定性大大提高，可在4℃穩定存放數月。這對研究SeNPs的治療效果及機制十分必要，可方便有效確定藥物濃度和保存。本研究在前期利用CS制備均勻、穩定的SeNPs顆粒的基礎上，對其穩定性、表面電荷等指標進行鑒定。并針對CS-SeNPs的毒性、抗氧化活性及作用機制做初步研究，以求獲得有潛在價值的治療二型糖尿病新型藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

亞硒酸鈉、CS和維生素C（Vc）購于Sigma-Aldrich（美國）；RPMI 1640培養基和胎牛血清購買于Gibco公司（美國）；MTT購于 R&D公司（美國）；DCFH-DA購于碧云天公司（中國）；透析袋購于Viskase公司（美國）；MGD購于Enzo公司（美國）。

透射電鏡（TEM），荷蘭Philips公司；掃描電鏡（SEM），日本Horiba公司；納米粒度儀，英國Malvern公司；冷凍離心機，德國Beckmann公司；分光光度計，美國Eppendorf公司；Multiskan FC酶標儀，美國賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 CS修飾的SeNPs制備 配制0.87 mg/mL的亞硒酸鈉母液，3.5 mg/mL的Vc母液，0.8 mg/mL的CS母液，在5 mL容量瓶中加入亞硒酸鈉母液1 mL，CS母液0.1 mL，渦旋混勻，再逐滴加入1 mL的Vc母液混勻，4℃反應8 h后避光透析，隔8 h換水，再透析48 h［15］。

1.2.2 SeNPs表征鑒定 通過電子顯微鏡和納米粒度儀對制備好的SeNPs樣品進行表征鑒定。TEM觀察樣品形貌，將樣品分散均勻，用銅網蘸取樣品，在電鏡下觀察樣品的大小、形貌和均勻性，并拍攝具有代表性的電鏡照片，利用SEM觀察樣品表面形貌。用納米粒度儀鑒定分析樣品的電位及其粒徑隨時間的變化。不同時間取保存樣品，檢測粒徑，驗證其穩定性。

1.2.3 細胞培養 胰島瘤細胞系INS-1購自武漢中科院。RPMI-1640中培養，添加10%FBS胎牛血清，80 mg/mL 青霉素，100 mg/mL鏈霉素，10 mmol/L HEPES和50 μmol/L的12-巰基乙醇，恒溫培養（5% CO2，37℃），細胞在6孔板（4×105個/孔）中鋪板，2 d后長滿底部用于胰島素檢測和Western blot。在96孔板（1×104個/孔）中鋪板，用于增殖、凋亡檢測，培養3 d用于后續實驗。

1.2.4 細胞凋亡模型 細胞內活性氧的增加，引起的氧化應激是胰島素抵抗、胰島β細胞凋亡以及二型糖尿病發展的中心環節。因此使用雙氧水處理胰島β細胞，選擇適當的濃度，通過增加細胞內ROS水平調控細胞凋亡，檢測藥物對胰島β細胞凋亡的影響。在96孔板中加入雙氧水，終濃度分別為0、10、25、50、100、200、1 000 μmol/L，1 h后吸取培養基，MTT法檢測細胞活性，最終取大約50%凋亡的H2O2濃度建立細胞凋亡模型。

1.2.5 檢測CS-SeNPs抗凋亡活性 用雙氧水制備細胞的凋亡模型，吸取培養基，加20 μL（10 mg/mL）MTT，孵育4 h，吸出MTT，加100 μL的DMSO，37℃孵育10 min，中間搖動幾次，570 nm測吸光度值。

1.2.6 檢測ROS水平 用DMSO溶解DCFH-DA，配置濃度為4 mmol/L的母液，使用時加入400 μL的KRBB配成溶液。將培養在96孔板的細胞先吸取培養基，加入50 μL的DCFH-DA溶液，37℃孵育30 min。PBS洗滌一次，37℃孵育30 min，以便細胞內DA充分與DCFH斷裂。加入藥物和雙氧水在37℃條件下于10、20、30、40、50和60 min用熒光酶標儀檢測，激發波長502 nm，發射波長530 nm。

1.2.7 檢測TrxR活性 TrxR是細胞內一類主要發揮抗氧化活性的含硒蛋白，多項研究證實硒酸鹽可激活TrxR活性，因此我們首先檢測了TrxR活性。

TrxR催化NADPH將DTNB還原為TNB，通過測定412 nm 波長處TNB的增加量，即可計算TrxR活性。在六孔板中培養細胞到鋪滿平面，加不同濃度CS-SeNPs處理1 h。隨后，每孔細胞加A液1 mL清洗，換1 mL的A液混勻細胞。4℃，1 000 r/min 5min，去上清。加入150 μL B液裂解細胞，渦旋30 s，冰浴30 min。4℃，13 400 r/min 5 min，取上清到預冷EP管中，冰浴。BCA定量檢測蛋白含量，采用TrxR活性檢測試劑盒按表1順序檢測TrxR活性。

表1 TrxR檢測順序

混勻后，412 nm處測在0 min和5 min的吸光值，0 min測得為A1，5 min測得為A2。

按下列方程計算TrxR活性：TrxR（U/mg）=（△A測定管-△A空白對照管）/6.75×10÷Cpr×1000。其中，△A=（A2-A1）/5，Cpr：蛋白濃度（mg/mL）。

1.2.8 檢測凋亡蛋白Caspase的活性 按照1.2.4方法，誘導細胞建模，并分正常細胞組、建模細胞組和建模細胞處理組，建模細胞處理組分CS-SeNPs高濃度（381 nmol/L）組和低濃度（38.1 nmol/L）組。處理好的細胞用PBS 洗滌兩次，加入細胞裂解液裂解，4℃ 12 000 r/min 離心15 min，取上清液進行SDS-PAGE，然后用電轉法轉移至PVDF膜，室溫下以5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Caspase-3、 Caspase-9和Caspase-12一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。TBST洗滌3次。以ECL 化學發光法曝光、顯影、定影。

1.2.9 模型鼠實驗 小鼠種屬：BKS.Cg-m +/+ Leprdb 糖尿病模型鼠。飼養條件：小鼠每3 d加滿飼料及飲水；環境，SPF級；溫度，18-22℃；相對濕度，50%-60%；藥物處理分為兩組：模型鼠分為模型組、模型治療治療組，每組3只，每日下午注射藥物1 mg/kg，4周后處死，取胰腺組織進行蘇木精-伊紅染色法（HE），進行觀察。

1.2.10 統計學檢測 應用SPSS17軟件進行統計分析，單組數據間使用t檢驗，多組數據間使用單因素方差分析，P＜0.05為有統計學意義，數據間標記相同字母表示無顯著差異，不同字母表示有顯著差異。

2 結果

2.1 CS-SeNPs表面形貌與粒徑分布

通過透射電鏡、掃描電鏡以及納米粒度儀檢測粒徑分布的結果。透射電鏡（圖1-A）顯示，CSSeNPs分布均勻，形態一致，呈球形，粒徑主要分布在90 nm左右。這是由于CS的羥基的作用，CS的羥基鍵可以和SeO32-反應形成一個穩定的中間化合物，因此CS修飾后的SeNPs形態更加均一穩定。另外，掃描電鏡結果（圖1-B）顯示，SeNPs被CS均勻的覆蓋在外面，CS-SeNPs表面光滑，分布均勻。納米粒徑分布結果（圖1-C）表明，溶液中CSSeNPs粒徑分布均勻，其粒徑主要分布在90 nm左右。

2.2 CS-SeNPs表面電位與穩定性

圖2-A顯示，SeNPs表面電荷為-3.6 mV，接近零價態，零價態物質一般穩定性差，CS-SeNPs表面電荷增加到24.8 mV，顯著增加了納米顆粒的穩定性。圖2-B顯示，CS-SeNPs的粒徑在保存時間的初期維持穩定，然后CS-SeNPs的粒徑在隨后一段時間出現輕微變化，但極少見到沉淀。在第120天的時候BAY-CS-SeNPs的粒徑迅速上升，且在第140天出現大量沉淀。CS-SeNPs在保存初期，由于表面負載大量高電荷CS，粒徑保持穩定。在第100天以后，由于CS的降解，SeNPs表面負載的CS逐漸減少，SeNPs開始發生聚合，從而導致粒徑迅速增大，出現沉淀渾濁。高穩定性的CS-SeNPs為其以后在生物醫藥中的應用奠定良好的基礎。

圖1 CS-SeNPs的表征

圖2 CS-SeNPs的表面電位（A）和穩定性（B）

2.3 細胞凋亡模型的建立以及硒毒性

由于SeNPs在高濃度時具有毒性，所以用梯度濃度CS-SeNPs孵育細胞，檢測細胞活性，確定CS-SeNPs的毒性范圍。按照逐漸遞增的濃度梯度（0.002、0.02、0.2、2、20、40 μmol/L） 檢 測 CSSeNPs對INS-1細胞的毒性，結果（圖3-A）顯示在濃度達到20 μmol/L時，CS-SeNPs的毒性發揮主要作用，開始促進細胞凋亡；在濃度達到40 μmol/L時細胞活性減少到正常對照組的72.41%，顯著小于對照，而CS-SeNPs在濃度小于2 μmol/L時，INS-1細胞增殖約50%。實驗結果表明，低濃度的CS-SeNPs具有顯著的促進細胞增殖活性，高濃度的CS-SeNPs抑制細胞增殖，對細胞有毒性，故選擇CS-SeNPs濃度低于2 μmol/L進行后續實驗。

圖3 CS-SeNPs的毒性與凋亡模型的建立

用雙氧水建立INS-1細胞的凋亡模型，用不同濃度的H2O2（10、25、50、100和1 000 μmol/L）處理細胞后，檢測這5個濃度狀態下的細胞活性。如圖3-B所示，50 μmol/L H2O2使細胞活性降低了47.61%，故在后續的實驗中采用50 μmol/L的雙氧水建立INS-1細胞凋亡模型。

2.4 CS-SeNPs抗凋亡活性及胞內氧化應激水平ROS如圖4-A所示，38.1 nmol/L的CS-SeNPs處理的細胞與模型對照組相比細胞活性提高31.75%，表明CS-SeNPs具有抗凋亡的活性。T2DM發展過程中，ROS水平的提高是引起胰島β細胞凋亡的主要原因。圖4-B顯示在CS-SeNPs處理50 min后，顯著抑制雙氧水引起的細胞ROS水平上升，表明CS-SeNPs能有效降低細胞內的ROS。

圖4 CS-SeNPs的抗凋亡作用

2.5 CS-SeNPs抗凋亡活性與細胞內ROS水平的關系

已有文獻顯示抗氧化蛋白TrxR通過還原Trx發揮降低細胞內ROS水平的作用，無機硒具有激活細胞內抗氧化蛋白TrxR的作用，因此有必要檢測TrxR的活性。圖5-A顯示，CS-SeNPs在38.1 nmol/L的時候顯著激活細胞內的TrxR活性。為了驗證TrxR所發揮的作用，本研究使用了TrxR的抑制劑MGD。圖5-B顯示，CS-SeNPs可以顯著抑制ROS引起的細胞凋亡，加入MGD能抑制CS-SeNPs的抗凋亡作用，MGD是TrxR的抑制劑，這說明CS-SeNPs通過激活細胞內TrxR活性發揮抗凋亡作用。

圖5 CS-SeNPs抗細胞凋亡的機制

圖5-C顯示，H2O2能使細胞內ROS水平升高，同時使細胞凋亡率升高；而CS-SeNPs可降低細胞內ROS水平，同時降低細胞凋亡率；MGD在抑制了CS-SeNPs的抗凋亡作用同時，也抑制了CS-SeNPs對胞內ROS的降低作用，而MGD是TrxR的抑制劑，說明CS-SeNPs是通過激活細胞內TrxR活性，降低細胞內ROS水平發揮抗INS-1細胞凋亡作用。

2.6 CS-SeNPs對細胞凋亡蛋白活性的影響

已有文獻［16-18］顯示，在發生氧化應激過程中，會激活細胞內的凋亡蛋白caspase 3、caspase 9、caspase 12，從而啟動凋亡過程。通過對caspase 3、caspase 9、caspase 12三種凋亡蛋白激活片段caspase 3（17 kD）、caspase 9（37 kD）、caspase 12（36 kD）的檢測，驗證CS-SeNPs對caspase激活的抑制作用。圖6顯示，抵抗模型細胞caspase活性顯著增高，而經藥物處理CS-SeNPs 1（38.1 nmol/L）和CS-SeNPs 2（381 nmol/L），顯著抑制caspase的激活，進一步驗證CS-SeNPs的抗凋亡活性。

圖6 CS-SeNPs對細胞凋亡蛋白活性的影響

2.7 胰島HE染色結果

圖7為糖尿病模型小鼠治療4周后胰腺HE染色結果。如圖7-A所示二型糖尿病模型組，胰腺細胞胞質較少，胰島增大，細胞核出現固縮壞死樣，顏色加深，散亂的分布于胰島中，且有不同程度的空泡樣變。具有外分泌功能的腺泡細胞可見變性和壞死。圖7-B為CS-SeNPs治療組，胰島邊緣較清晰，胰島細胞核有少量變形，細胞分布較均勻，細胞結構較完整，胞漿較豐富，病癥較模型組明顯減輕。

3 討論

目前已有多種方法可用于制備SeNPs，包括氣相蒸發凝聚法、無外源調控液劑相法、有外源調控劑液相法。其中有外源調控劑液相法，通過還原劑的選擇、陳化條件及時間的調整，可有效調控納米粒子形貌。在此基礎上，通過在制備的納米粒子表面連接不同材料，可增加納米粒子的溶解性、吸附性，還可以通過靜電吸附、共價偶聯等方式連接蛋白、化學藥物，改善藥物的藥代動力學特性。本課題組主要目的在于在SeNPs表面覆蓋CS，由于CS自帶大量正電荷，大大提高SeNPs表面電荷水平，進而提高納米粒子穩定性。通過對還原劑濃度、陳化條件的調整，制備了粒徑均勻，高表面電荷CS-SeNPs顆粒，經檢測，穩定保存時間可達3個月，為后續實驗提供了穩定的藥品來源。

圖7 胰島組織HE染色結果

已有文獻報道，我們人體內存在許多還原性的含硒酶類，這些酶可有效降低細胞內的ROS水平，而它們的活性與體內硒濃度息息相關，補充硒酸鹽可以增加這些酶的活性。而無機硒酸鹽可直接激活TrxR［12］，所以本課題組的研究方向就放在了對TrxR的激活上。前文提到SeNPs的生物學活性主要在于降低了毒性，有利于成為藥物，通過檢測我們選擇了一個遠低于毒性劑量的CS-SeNPs濃度。通過對含硒蛋白活性的檢測，發現CS-SeNPs可有效激活細胞內TrxR的活性，進而降低細胞內的ROS水平，發揮抗凋亡活性。在糖尿病領域，從長期來看，由于細胞ROS水平升高造成的胰島β細胞凋亡是二型糖尿病發展的主要病因，在周圍組織以及肝臟等器官，由于脂肪的胞內積累、高糖高脂外環境，以及高糖高脂誘發的炎癥都會升高胞內的ROS水平。因此降低細胞ROS水平，對于延緩糖尿病進程，以及輔助常規藥物治療二型糖尿病保護胰島β細胞功能以及保護周圍組織方面將具有良好的應用前景。

在糖尿病藥物研究中，往往關注藥物在及時改善疾病指標中的作用。然而像糖尿病這樣一類慢性病，尤其是發生了胰島素抵抗，比較嚴重的患者，短期的治療可以迅速改善某些疾病指標，但難以迅速從根本上扭轉相關組織的器質性病變。如果想徹底治愈糖尿病，扭轉相關組織的器質性病變，恢復其響應人體信號功能，減輕胰島素抵抗十分重要。簡單刺激胰島細胞分泌胰島素或促進周圍組織吸收葡萄糖，增強病態細胞功能有可能對細胞造成新的損傷，在治療時應考慮保護細胞，減少細胞凋亡，增加細胞活性作為藥物治療的輔助措施。SeNPs具有保護細胞避免凋亡的活性作用，具有潛在的長期的治療價值。保護組織細胞避免凋亡，恢復其正常體內信號響應，扭轉相關組織的器質性病變相關藥物有可能成為以后藥物研發的熱點。

4 結論

相對于硒酸鹽，CS-SeNPs具有顯著的高效低毒特點，初步解決了毒性問題，并且能通過激活TrxR降低胞內ROS抑制凋亡蛋白的激活，有效降低胰島β細胞凋亡，具有成為二型糖尿病治療藥物的潛力。

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（責任編輯 李楠）

Effect and Mechanism of Selenium Nanoparticle Against Islet β Cell Apoptosis

RAO Lei1RAO Min2QIU Hong-hong1LI Hong-hui1LIU Jing1ZHUANG Man-jiao3
（1. Biomedical Science，Chengdu Medical College，Chengdu 610500；2. Bengbu 94565 Troops Medical Corp，Bengbu 233000；3. College of Life Science，Guangzhou University，Guangzhou 510006）

The purpose of this research was to study the effect and molecular mechanism of selenium nanoparticles（SeNPs）in the treatment of islet β cell apoptosis in type 2 diabetes mellitus. Electron microscope and nanoparticle size analyzer were used to identify SeNPs surface morphology，and relevant molecular biological techniques were used to validate the protection effect and mechanism of SeNPs on islet β cells apoptotic model. Results showed that the surface charge of selenium nanoparticle decorated by chitosan（CS）increased to 24.8 mv，and its storage time was extended to over 100 days. Cytology results showed that SeNPs under 2 μmol/L had no toxicity. Meanwhile，SeNPs in 38.1 nmol/L activated TrxR activity and reduced intracellular ROS level，which led to apoptotic model cells survival rate significantly increased 31.75%. Furthermore，the animal experiments also verified that SeNPs could resist the apoptosis of islet cell β. In conclusion，SeNPs may eliminate the apoptosis of islet cell β in type 2 diabetes mellitus，which shows a potential therapeutic activity in the treatment of type 2 diabetes.

selenium nanoparticle；type 2 diabetes mellitus；oxidative stress；molecular mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.035

2016-07-04

四川養老中心項目（YLZBZ1517）

饒磊，男，博士研究生，講師，研究方向：納米藥物；E-mail：591617735@qq.com

莊滿嬌，女，博士研究生，研究方向：藥理；E-mail：519797252@qq.com