維生素K2合成途徑中主要酶對MK-7產量的影響

徐建中 王穎妤 嚴為留 張偉國

（江南大學生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122）

維生素K2合成途徑中主要酶對MK-7產量的影響

徐建中 王穎妤 嚴為留 張偉國

（江南大學生物工程學院 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122）

對菌株Y-2維生素K2合成途徑中的6個主要酶基因分別進行克隆和表達，以探索不同酶基因對MK-7產量的影響。參照《分子克隆實驗指南》完成對基因重組質粒的構建，并對spizizen轉化法進行改進，實現重組質粒對菌株Y-2的轉化。結果表明，分別過量表達維生素K2合成途徑中的6個基因均能提高MK-7的產量。需要指出的是，過表達基因hep S對MK-7產量的影響最大，其中在搖瓶培養組的產量提高了38%，靜置培養組的產量提高了48%。其余幾個基因過表達后對MK-7產量的影響則根據培養方式的不同而各有差異。

解淀粉芽孢桿菌；甲萘醌-7；合成途徑；催化酶

甲萘醌-7是維生素K2（又稱甲萘醌，MK-n）中的一員，因甲基萘醌母環C-3位置上含有7個異戊二烯單元的異戊二烯側鏈組成，因而稱為MK-7（圖1）。MK-7具有較長的半衰期，可在血液中穩定存在，因而是哺乳動物中凝血因子II、VII、IX和X的一個重要的輔因子，參與血液凝固［1，2］。在調節骨骼生長方面，因MK-7可以抑制成骨細胞的生長，從而刺激成骨細胞的分化，形成骨頭。國外學者指出，補充一定量的MK-7能夠提高骨頭中的礦物質密度（BMD），降低髖骨骨折風險［3］，還有利于提高骨鈣蛋白的羧化作用［4］。此外，MK-7可降低血壓［5］，促進以神經生長因子為媒介的PC 12D細胞的軸突生長［6］，通過調控Ca2+的利用和促進Gla蛋白質（matrix gla protein，MGP）的活性，防止鈣質在血管中沉淀而造成的動脈硬化［7］等。MK-7具有多種生理功能，因此MK-7作為新一代的保健食品，其功能正在受到越來越多的關注。

MK-7等維生素K2同系物都是由一個相同的甲萘醌母環和含有不同異戊二烯單元個數的側鏈組成。其中甲萘醌母環是從赤蘚糖-4-磷酸開始合成，經過莽草酸、分枝酸、異分枝酸、2-琥珀酰-6-羥基-2，4-環己二烯-1-羥酸（SHCHC）以及鄰苯甲酸（OSB）等中間化合物，合成萘醌母環1，4-二羥基-2-萘甲酸DNHA。其中分枝酸又是合成酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸3種芳香族氨基酸的前體物質，因此甲萘醌母環的合成又會受到這3種氨基酸的反饋抑制。乙酰CoA是異戊二烯側鏈合成的起始化合物，經過甲羥戊酸、異戊烯焦磷酸、牛兒基香葉基焦磷酸等中間物質，合成側鏈聚異戊二烯焦磷酸。萘醌母環和側鏈經酶催化合成后再經過一步甲基化反應就合成了最終的維生素K2。圖1是作者根據KEGG公布的代謝網絡繪制的MK-7合成途徑［8］，在這個過程中，共有8個酶控制從異分枝酸開始的甲萘醌母環的合成以及從異戊烯焦磷酸開始的側鏈的合成，共有9個基因參與這一過程，它們分別是men A、men B、men C、men D、men E、men G、men H、hep T和hep S，其中hep T和hep S控制同一個酶的兩個亞基的合成。這些合成基因的公布對進一步研究維生素K2的代謝途徑具有重要的意義。以此為研究背景，本研究考察MK-7合成途徑中上述酶基因過表達后對MK-7合成的影響，旨為探討MK-7合成途徑中代謝調控機制和為后期采用代謝工程手段選育高產MK-7菌株提供理論參考和現實依據。

1 材料與方法

1.1 材料

圖1 MK-7的合成途徑

1.1.1 實驗菌株與質粒 篩選獲得的解淀粉芽孢桿菌Y-2（Bacillus amyloliquefaciens Y-2），保藏于武漢中國典型微生物保藏中心（CCTCC），保藏號：CCTCC M 2013493。大腸桿菌JM109（Escherichia coli JM109）、枯草芽孢桿菌168（Bacillus subtilis 168）、質粒pMA5保藏于本實驗室。

1.1.2 培養基及培養方法 種子培養基（g/L）：葡萄糖15、蛋白胨15、KH2PO41、K2HPO4·3H2O 2.5、MgSO4·7H2O 2.5，pH7.0-7.2。發酵培養基（g/L）：1 L 玉米粉液化液（玉米粉在100℃下經高溫α-淀粉酶處理30 min）、豆粕粉41.52，大豆蛋白胨16.31、酵母膏15.51、K2HPO4·3H2O 0.13、NaCl3.11，pH7.0-7.2。LB培養基（g/L）：酵母提取物5、胰蛋白胨10、NaCl 10、pH7.0-7.2添加5 g/L葡萄糖即為LBG培養基，添加15 g/L瓊脂即為相應的固體培養基，必要時補加終濃度為100 mg/L氨芐青霉素用于重組大腸桿菌的篩選或者50 mg/L卡那霉素用于重組芽孢桿菌的篩選。B. subtilis轉化培養基：① SPI培養基（20 mL）：9.8 mL SPI-A鹽溶液（2 μL Na3C6H5O7·2H2O、4 g/L（NH4）2SO4、28 g/L K2HPO4·3H2O，12 g/L KH2PO4）、9.8 mL SPI-B溶液（0.4 g/L MgSO4·7H2O）、200 μL 100×CAYE溶液（20 g/L酪蛋白水解物，100 g/L酵母提取物）、200 μL 500 g/L葡萄糖溶液；② SPII培養基（6 mL）：5.88 mL SPI培養基，60 μL 50 mmol/L CaCl2溶液，60 μL 250 mmol/L MgCl2溶液。B. amyloliquefaciens轉化培養基配方基本同上，只是在SPI-B鹽溶液中加入終濃度為40 mL/L吐溫-80，其他組分不變。除發酵培養基外，其他培養基在0.1 MPa下高壓滅菌20 min，而發酵培養基在0.07 MPa下高壓滅菌20 min。菌體培養溫度為（37±1）℃，培養時間為8-12 h。非特殊說明，在搖瓶發酵培養時將對數生長期的種子液按2%（v/v）接種量轉接于發酵培養基中，在（37± 1）℃條件下的往復式搖床上培養。

1.2 方法

1.2.1 感受態細胞的制備與轉化方法 E. coli感受態細胞的制備與轉化方法參照Green和Sambrook指出的方法，采用CaCl2溶液處理制備E. coli感受態細胞并采用冰浴熱激的方法實現細胞轉化［9］。采用李瑞芳等［10］的方法，完成對B. subtilis和B. amyloliquefaciens感受態細胞的制備與轉化。

1.2.2 重組菌株的構建 首先通過PCR擴增反應獲得不同基因的片段，其中片段大小、所使用的引物及其PCR條件如表1所示。隨后，參照Sambrook和Russel建立的遺傳改造方法，構建含有不同基因的重組表達質粒（圖2）。最后，參照經典的芽孢桿菌轉化法（即spizizen轉化法）［11］，將上述構建好的重組質粒轉化到B. subtilis 168或菌株Y-2，獲得不同重組菌株。

1.2.3 MK-7的提取與檢測方法 參照Berenjian等［12］和嚴為留等［13］建立的方法對樣品中MK-7進行提取，整個提取過程盡量避光，同時增加萃取次數以提高提取效率。利用高效液相色譜法（HLPC）檢測MK-7時參照嚴為留等［13］建立的方法，MK-7濃縮液經上機液溶解后采用0.22 μm微孔濾膜過濾，然后進行HLPC分析。液相色譜條件及進樣量參照嚴為留等［13］設定的參數。

2 結果

表1 本研究擴增基因片段大小、使用的引物及PCR條件

2.1 重組質粒的構建

前期對實驗室保藏的一株高產MK-7的B. amyloliquefaciens Y-2和只有微弱MK-7合成能力的B. amyloliquefaciens W-21的同一基因進行測序對比，發現其中有6個基因序列差別較大，分別為men A、men C、men D、men E、men H和hep S，因此對這6個基因進行研究。根據測序和比對結果，設計這6個基因的開放閱讀框（ORF）全長的擴增引物，并根據設計的引物分別擴增這6個基因，將得到的6個基因片段分別構建到大腸桿菌B. subtilis穿梭型質粒pMA5（簡稱P5）上，重組質粒構建過程見圖2。為判斷獲得的重組質粒的正確性，對構建好的重組質粒進行了單雙酶切驗證。從圖3中可以看出，酶切得到的基因片段大小和目的基因片段一致（表1），因此可以推斷所獲質粒確實為目的重組質粒。與基因名稱相對應，所構建的重組質粒分別命名為P5-A、P5-C、P5-D、P5-E、P5-H和P5-S。

2.2 重組質粒在B. subtilis 168中的表達

圖4 出發菌株168和重組菌株的MK-7產量

B. subtilis 168自首次被發現能夠攝取外源DNA以來，國內外學者已經對其轉化機制進行了透徹的研究，最經典的spizizen轉化法對常見質粒轉化都能獲得較高的轉化效率［11，14］。此外，B. subtilis 168的表達系統比較完善，容易驗證目的基因是否能夠成功表達。因此，本研究考察了不同重組質粒在B. subtilis 168中過表達對MK-7合成的影響。利用spizizen轉化法篩選B. subtilis 168的陽性轉化子，分別命名為168/P5-A、168/P5-C、168/P5-D、168/P5-E、168/P5-H和168/P5-S。將上述重組B. subtilis分別接種到添加了50 mg/L卡那霉素的表達培養基中，在37℃，100 r/min的條件下培養24 h后，離心收集菌體，并利用有機溶劑萃取后檢測MK-7含量。結果（圖4）顯示，重組菌株的MK-7產量均高于對照菌株168（54.3±7.2 μg/g DCW），特別是菌株168/P5-A（155.1±5.5 μg/g DCW），MK-7產量提高了185.6%；其次是菌株168/P5-D（89.0±2.3 μg/g DCW）和菌株168/P5-C（85.6±3.2 μg/g DCW），產量分別提高了64.1%和57.5%；其他菌株168/P5-S（60.6±7.1 μg/g DCW）、168/P5-E（58.3±1.8 μg/g DCW）和168/P5-H（55.9±5.3 μg/g DCW），MK-7產量分別提高了11.6%、7.4%和2.9%。然而，需要注意的是，將空載質粒pMA5轉化到菌株168后（即重組菌株168/P5），MK-7產量反而下降（38.7±4.6 μg/g DCW）。以上結果表明，目的基因在B. subtilis 168中均成功實現了表達，且過表達的基因對MK-7的合成起到促進作用。

2.3 B. amyloliquefaciens Y-2的感受態細胞制備和轉化

雖然B. amyloliquefaciens和B. subtilis的親緣關系較近，但將來源于B. subtilis 168的重組質粒用spizizen轉化法轉化B. amyloliquefaciens Y-2時，仍不能獲得有效的轉化子。這就說明菌株Y-2的細胞膜通透性較一般的野生型芽孢桿菌要低，要想成功轉化質粒，則必須要增強Y-2的細胞膜通透性。因此，本研究首先考察了吐溫-80的添加量對菌株Y-2轉化率的影響。以spizizen轉化法為基礎，在SPII培養基中添加不同體積比的吐溫-80發現，添加40 mL/L的吐溫-80能獲得15-25個轉化子，因此在接下來的實驗中就以改進后的spizizen轉化法轉化菌株Y-2，重組質粒還是來源于B. subtilis 168。通過采用改進的spizizen轉化法，成功將6個重組質粒分別轉化野生型B. amyloliquefaciens Y-2，獲得重組菌株Y-2/P5、Y-2/P5-A、Y-2/P5-C、Y-2/P5-D、Y-2/P5-E、Y-2/P5-H和Y-2/P5-S。隨后考察了出發菌株和重組菌株在表達培養基中菌體生長情況。結果（圖5）表明，重組菌的生長速率均要慢于野生菌，但是最大菌體量都比野生菌高。

圖5 重組Y-2的生長曲線

2.4 不同酶基因對MK-7產量的影響

由于野生型Y-2在搖瓶培養和靜置培養的條件下均能夠合成MK-7，其中搖瓶培養條件下產（138.4±8.5）μg/g DCW MK-7，而靜置培養MK-7產量達（154.7±13.1）μg/g DCW。雖然菌體在靜置培養的條件下能夠合成更多的MK-7，但是在搖瓶培養下質粒能夠得到更多的復制和表達，進而也能夠促進MK-7的合成。因此作者對各重組菌在這兩種培養條件下的MK-7產量均進行了研究，結果見圖6所示。

圖6 重組Y-2在搖瓶培養（A）和靜置培養（B）條件下的MK-7產量

從圖6中可以看出，分別過量表達上述6個基因均能提高MK-7的產量，其中過表達基因hep S對MK-7產量的影響最大，如搖瓶組產量提高了38%（191.0±12.7 μg/g DCW），靜置培養組產量提高了48%（228.9±7.6 μg/g DCW），其余幾個基因的表達對MK-7合成的影響則根據培養方式的不同而各有差異。此外，與將空載質粒pMA5轉化到菌株168類似，攜帶有空載質粒pMA5的重組菌株Y-2/P5的MK-7生產能力要低于菌株Y-2。

3 討論

MK-7生物合成途徑中共有8個酶控制從異分枝酸開始的甲萘醌母環的合成以及從異戊烯焦磷酸開始的側鏈的合成，有9個基因參與這一過程，它們分別是men A、men B、men C、men D、men E、men G、men H、hep T和hep S［8］。然而，我們前期研究發現不同MK-7生物合成水平的菌株中，6個基因（即men A、men C、men D、men E、men H和hep S）的基因序列差別較大（實驗結果未指出），因此本研究重點考察了這6個基因過表達對MK-7合成的影響。

與孫娟娟等［15］在研究過程中相同，從大腸桿菌中提取的重組質粒直接轉化B. amyloliquefaciens Y-2的轉化率非常低，基本無法轉化。其原因可能是在B. amyloliquefaciens中存在著一種由限制性內切酶和甲基化酶組成的限制修飾系統，從而使得B. amyloliquefaciens對外源DNA具有較強的降解能力［16，17］。從進化距離來看，B. amyloliquefaciens和B. subtilis有著較近的親緣關系。Akamatsu和Taguchi［11］指出，從大腸桿菌中提取的重組質粒能以較高的轉化率直接轉化到B. subtilis 168。因此，我們前期研究考察了將構建好的質粒先轉化到B. subtilis 168中，再從重組B. subtilis 168中提取可能經過修飾的質粒轉化野生型B. amyloliquefaciens Y-2，以期實現提高轉化的成功率。然而，實驗結果表明轉化的成功率并未得到提高，可能的原因是菌株Y-2的細胞膜通透性低。表面活性劑，如吐溫-80等，能夠降低目的蛋白與細胞膜之間的相互作用，促進目的蛋白在芽孢桿菌中的分泌表達［18］。魏艷等［19］比較了表面活性劑吐溫-80與DMSO等有機溶劑對野生型B. subtilis NX-2的轉化效率的影響，結果表明，添加吐溫-80的轉化率較為穩定，而有機溶劑的促轉化作用則不太穩定。因此，本研究以spizizen轉化法為基礎，在SPII培養基中添加40 mL/L的吐溫-80，從而實現了將外源重組質粒轉化到菌株Y-2。

在考察了不同重組質粒在B. subtilis 168中過表達對MK-7合成的影響時發現，目的基因在B. subtilis 168中均成功實現了表達，且MK-7的合成起到促進作用（圖4）。其中，過表達基因men A對B. subtilis 168合成MK-7具有顯著的促進作用。該結果與Kong等［20］研究結果相似，他們在研究了大腸桿菌中甲萘醌-8（MK-8）的合成途徑時發現，過表達基因men A可使大腸桿菌合成MK-8含量提高2倍。此外，將不同重組表達質粒在B. amyloliquefaciens Y-2中過表達，對菌體生長和MK-7的合成也具有不同的影響。圖5顯示，重組菌的生長速率均要慢于野生菌，但是最大菌體量都比野生菌高。這可能是因為在菌體生長前期，質粒的復制加重了菌體的負擔，但是當質粒表達后，增強了菌體呼吸鏈中的電子傳遞效率，提高了菌體的呼吸強度，從而增加了最大菌體量。與在B. subtilis 168過表達不同，雖然6個目的基因的過表達對B. amyloliquefaciens合成MK-7具有促進作用，但是起關鍵作用的基因是hep S。基因hep S和基因hep T一起，控制MK-7側鏈合成酶——七異戊烯焦磷酸合成酶（EC：2.5.1.30）兩個亞基的合成［20］。此外，需要指出的是在不同培養條件下，除基因hep S外，其他基因對MK-7合成的影響存在差別，特別是基因men E（圖6）。因此作者推斷，在MK-7的合成途徑中，不同培養條件下基因的表達水平存在差異，培養條件的改變可能也會導致酶的調控方式發生改變。非常有趣的是，將空載質粒pMA5轉化到B. subtilis 168或菌株Y-2會導致出發菌株合成MK-7的能力下降（圖4和圖6）。具體的調節機制還不明了，因此我們推斷是由于質粒pMA5轉入可能會影響細胞內基因表達水平的改變，從而影響MK-7的產量，具體原因還需做進一步研究。

4 結論

本研究對一株產MK-7的菌株B. amyloliquefaciens Y-2維生素K2合成途徑中的6個主要酶基因分別進行克隆和表達，指出了過量表達菌株Y-2維生素K2合成途徑中6個基因的任何一個均能提高MK-7的產量，其中過表達基因hep S對菌株Y-2合成MK-7影響最大，特別是在靜置培養時可使MK-7產量提高48%。其余幾個基因過表達后對MK-7產量的影響則根據培養方式的不同而各有差異。

［1］Wu WJ, Ahn BY. Isolation and identification of Bacillus amyloliquefaciens BY01 with high productivity of menaquinone for cheonggukjang production［J］. J Korean Soc Appl Biol Chem, 2011, 54（5）：783-789.

［2］Ebrahiminezhad A, Varma V, Yang S, et al. Magnetic immobilization of Bacillus subtilis natto cells for menaquinone-7 fermentation［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100：173-180.

［3］ Forli L, Bollerslev J, Simonsen S, et al. Dietary vitamin K2supplement improves bone status after lung and heart transplantation［J］. Transplantation, 2010, 89（4）：458-464.

［4］Berenjian A, Chan NLC, Mahanama R, et al. Effect of biofilm formation by Bacillus subtilis natto on Menaquinone-7 biosynthesis［J］. Mol Biotechnol, 2013, 54：371-378.

［5］Kim YK, Kim SM, Kim JY, et al. The culture filtrates from Bacillus subtilis natto lowers blood pressure via rennin-angiotersin system in spontaneously hypertensive rats fed with a high-cholesterol diet［J］. J Korean Soc Appl Biol Chem, 2011, 54（6）：959-965.

［6］Tsang CK, Kamei Y. Novel effect of vitamin K, （phylloquinone）and vitamin K2（menaquinone）on promoting nerve growth factormediated neurite outgrowth from PC 12D cells［J］. Neurosci Lett, 2002, 323：9-12.

［7］Kresimir P, Henrik R, Tom P. Safety and toxicological evaluation of a synthetic vitamin K2, menaquinone-7［J］. Toxicol Mech Methods, 2011, 21（7）：520-532.

［8］KEGG PATHWAY［DB/OL］. Http://www. genome. jp/keggbin/show_pathway?map=map00130&show_description=show, 2013-05-28.

［9］薩姆布魯克 J, 拉塞爾 DW. 分子克隆實驗指南［M］. 第3版.黃培堂, 譯. 北京：科學出版社, 2008.

［10］李瑞芳, 薛雯雯, 黃亮. 枯草芽孢桿菌感受態細胞的制備與質粒轉化方法研究［J］. 生物技術通報, 2011, 5：227-230.

［11］Akamatsu T, Taguchi H. Plasmid transformation of competent Bacillus subtilis by lysed protoplast DNA［J］. J Biosci Bioeng, 2012, 114：138e143.

［12］Berenjian A, Mahanama R, Talbot A, et al. Efficient media for high menaquinone-7 production：response surface methodology approach［J］. New Biotechnol, 2011, 28：665-672.

［13］嚴為留, 張偉國, 錢和, 等. 納豆芽孢桿菌發酵生產MK-7的產物提取與檢測［J］. 食品與生物技術學報, 2013, 32（8）：891-895.

［14］Spizizen J. Transformation of biochemically deficient strains of Bacillus subtilis by deoxyribonucleate［J］. Proc Nat Acad Sci USA, 1958, 44：304-310.

［15］孫娟娟. 普魯蘭酶在解淀粉芽孢桿菌中表達方法的探索［D］.無錫：江南大學, 2011.

［16］劉洋, 沈微, 石貴陽, 等. 解淀粉芽孢桿菌Bam HI甲基轉移酶基因克隆、功能鑒定與序列分析［J］. 生物技術通報, 2009（11）：65-68.

［17］Connaughton JF, Vanek PG, Lee LQ, et al. Cloning of the Bam HI methyl transferase gene from Bacillus amyloliquefaciens［J］. Gene Anal Tech, 1988, 5（6）：116-124.

［18］傅明亮, 董亞晨, 劉曉杰, 等. 表面活性劑與氧載體對地衣芽孢桿菌ZJUEL31410發酵產彈性蛋白酶的影響［J］. 中國食品學報, 2011, 2：17-23.

［19］魏艷, 張丹, 蔡恒, 等. 適用于野生型枯草芽孢桿菌轉化有機溶劑方法的建立和優化［J］. 生物學通報, 2011, 46（12）：42-45.

［20］Kong MK, Lee PC. Metabolic engineering of menaquinone-8 pathway of Escherichia coli as a microbial platform for vitamin K production［J］. Biotechnol Bioeng, 2011, 108（8）：1997-2002.

（責任編輯 馬鑫）

Effects of Major Enzymes in the Biosynthetic Pathway of Vitamin K2on MK-7 Production

XU Jian-zhong WANG Ying-yu YAN Wei-liu ZHANG Wei-guo
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

This paper focused on understanding the effects of different enzyme genes on MK-7 production by cloning and expressing the genes of 6 enzymes in the biosynthetic pathway of vitamin K2with strain Y-2. Firstly，the recombinant plasmids with single gene of the 6 genes were constructed according to the description of Guide to Molecular Cloning Experiment. Subsequently，the recombinant plasmids were successfully transformed into the strain Y-2 via the improved “spizizen” transformation method. Results showed that respective overexpression of the 6 genes involved in vitamin K2biosynthetic pathway all was beneficial to raise MK-7 production. It should be noted that overexpression of gene hep S had the greatest effects on MK-7 production among these 6 genes，which resulted in an increase by 38% in shaking group and by 48% in static group. However，the effects of other genes on MK-7 production varied depending on the culture mode.

Bacillus amyloliquefaciens；menaquinone-7；biosynthetic pathway；catalyzing enzyme

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.032

2016-04-19

項目名稱：江蘇省自然科學基金-青年基金項目（BK20150149）

徐建中，男，博士，研究方向：菌種選育及代謝調控；E-mail：xujz126@126.com

張偉國，男，博士，研究方向：菌種選育及代謝調控；E-mail：zwgjnedu@sina.cn