利用原生質體融合技術構建耐酸絮凝性產乙醇釀酒酵母

茍敏 楊白雪 湯岳琴 木田建次

（四川大學建筑與環境學院，成都 610065）

利用原生質體融合技術構建耐酸絮凝性產乙醇釀酒酵母

茍敏 楊白雪 湯岳琴 木田建次

（四川大學建筑與環境學院，成都 610065）

為獲得具有多種優良性狀的高效乙醇生產菌株，以絮凝性釀酒酵母RHZ-1及耐酸耐溫釀酒酵母SEB2為親本，通過紫外誘變獲得營養缺陷型標記菌株，并利用原生質體融合技術選育耐酸絮凝性釀酒酵母。通過對融合子的篩選獲得一株優秀的耐酸絮凝性釀酒酵母菌株RS-1；該菌株在30℃，pH2.2，15% YPD條件下發酵24 h，乙醇產生量為47.87 g/L，糖消耗速率和基于糖消耗的乙醇收率分別比親本菌株RHZ-1提高了19.5%和9.8%。在35℃，pH2.2，15% YPD條件下發酵48 h，乙醇產生量為38 g/L，糖消耗速率和乙醇收率分別比親本菌株RHZ-1提高了46.8%和21.6%。結果表明，獲得的菌株可為提高燃料乙醇的生產效率奠定基礎。

釀酒酵母；紫外誘變；原生質體融合；耐酸性；乙醇發酵

生物乙醇被認為是傳統燃料的重要替代品［1］。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）憑借較高的糖發酵能力、乙醇耐受性及生物安全性，已成為生產燃料乙醇的首選微生物［2］。大規模工業化生產常通過降低發酵體系的pH值來控制雜菌污染，但釀酒酵母的最適pH值為4.0-5.0，較低的pH會影響酵母的生長及發酵能力［2］。此外，木質纖維素已成為燃料乙醇生產的重要原料。利用其制備燃料乙醇通常包括木質纖維素的預處理、纖維素水解，以及糖類發酵產乙醇3個關鍵步驟［1］。而木質纖維素經稀酸預處理后的水解液pH較低，導致后續過程中酵母的生長及發酵受到抑制［2，3］。調節水解液pH值會增加木質纖維素資源化的成本，同時也易提高發酵體系遭受外源微生物污染的風險［4］。選育優良的耐酸性釀酒酵母是提高乙醇產量并控制雜菌污染的必然選擇。此外，絮凝性酵母具有的高微生物密度能提高其乙醇耐受性，且易與產物分離的特性更適用于工業發酵過程［5-7］。因此，培育多優良性狀的絮凝性釀酒酵母在乙醇工業上具有廣闊的應用前景。

微生物選育的方法包括定向進化，基因工程及原生質體融合等。酵母的耐酸機制較為復雜，目前報道較多的有質子泵、胞內堿性物質的產生、大分子的保護和修飾、細胞膜組分的變化、代謝途徑的改變和其它調節因子的作用等［4］。因此，通過基因工程的手段，如僅改變某個或某些基因，難以實現優良耐酸菌株的篩選；依靠選擇壓力下微生物自然變異的定向進化技術又存在耗時費力的缺點［8］。針對機理尚不明確的微生物育種，源于基因組重組的原生質體融合技術是一種理想方法。它指通過物理（如電融合）、化學（如聚乙二醇）或生物（如仙臺病毒）的誘導作用，將遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質體進行融合，以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩定重組子的過程，具有無需了解控制性狀的機理及遺傳物質交換完整等優勢［9］。利用原生質體融合技術提高釀酒酵母的性能，多數研究集中在耐溫高產乙醇菌株的選育，對耐酸菌的報道相當有限［10］。因此，本研究旨在利用原生質體融合技術，構建具有高效產乙醇能力的耐酸絮凝性釀酒酵母，為乙醇工業生產提供優良的微生物菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發菌株 絮凝性高效產乙醇釀酒酵母RHZ-1及耐酸耐溫釀酒酵母SEB2均由本實驗室選育保存。

1.1.2 培養基 2% YPD培養基（g/L）：葡萄糖20，酵母浸出粉10，蛋白胨20；MM培養基（g/L）：無氨基酵母氮源1.7，酵母粉10，葡萄糖 20，2% YPDU培養基（g/L）：蛋白胨2，硫酸銨1，葡萄糖20；尿嘧啶0.04；15% YPDU培養基：2% YPDU培養基中葡萄糖濃度為150 g/L。山梨醇高滲再生培養基（YEPDS）：在2% YPD培養基中加入0.9 mol/L山梨醇。在配制固體培養基時加入2%的瓊脂粉，所有培養基均在121℃條件下滅菌15 min后使用。

1.1.3 試劑 無氨基酵母氮源、PEG4000購自Sigma公司；山梨醇、巰基乙醇、以及用于營養缺陷類型鑒定的營養物質購自Amresco公司；Zymolyase-20T購自MP Biomedicals公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 紫外誘變選育親本營養缺陷型標記菌株

1.2.1.1 最佳紫外誘變時間的確定 將菌株RHZ-1及SEB2分別轉入2% YPD液體培養基中，30℃活化16 h。菌液經無菌水稀釋后涂布到YPD平板上，將平板置于25 W已預熱過的紫外燈下20 cm處照射不同時間后，于30℃靜置培養。通過比較紫外誘變前后平板長出的菌落數，計算菌株的存活率，以確定最佳的紫外誘變時間。

1.2.1.2 營養缺陷型標記菌株的篩選 經紫外誘變50 s后的親本菌株于30℃靜置培養2 d，將平板長出的菌落影印至MM平板，30℃過夜培養。對比YPD及MM平板長出的菌落，從YPD平板上挑選出無法在MM平板生長的菌落，即營養缺陷型標記菌。將這些菌株反復接種到YPD及MM平板上培養驗證，獲得穩定的營養缺陷型標記菌株。隨后將這些菌株涂布到含不同營養物質（包括20種天然氨基酸、尿嘧啶、肌醇及腺嘌呤硫酸鹽）的MM平板上，根據其在平板上的生長能力，鑒定營養缺陷類型。同時，對營養缺陷型標記菌株進行絮凝性，耐酸能力及發酵性能的評價，以獲得最佳的親本營養缺陷型標記菌株。

1.2.2 原生質體的制備與再生 取2個親本的營養缺陷型標記菌株，分別接種至100 mL的2% YPD培養基中，于30℃，160 r/min下培養12 h；將適量培養液裝入50 mL離心管中，3 000 r/min離心5 min收集菌體；菌體經0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗后，加入20 mL 預處理液（60 mmol/L EDTA-0.1 mol/L磷酸緩沖液和40 μL巰基乙醇），于30℃均勻振動30 min，3 000 r/min離心5 min收集菌體；添加20 mL終濃度為0.025 mg/mL的酵母細胞壁溶解酶（Zymolyase-20T），于30℃輕輕振蕩1.5 h后，3 000 r/min離心5 min收集菌體；加入20 mL的0.6 mol/L KCl-0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗菌體，2 000 r/min離心5 min后收集菌體，并將菌體懸浮于5 mL的0.9 mol/L山梨醇-0.1 mol/L磷酸緩沖液中備用。

原生質體形成率及再生率測定方法如下：取溶解酶處理前的菌懸液，經無菌水稀釋后，涂布在2% YPD平板上，于30℃下培養2 d，記錄酶解前菌落數（A）；取溶解酶處理后的菌懸液，經無菌水稀釋后涂布到2% YPD平板上，于30℃下培養2 d，記錄未破壁菌落數（B）；取原生質體菌懸液，涂布于YEPDS平板上，在30℃下培養2 d，記錄再生菌落數（C）；根據A、B、C值計算原生質體的形成率及再生率。

1.2.3 原生質體細胞的融合 取2個親本菌株的原生質體懸浮液（2×107/mL），按1∶1體積比（各取0.5 mL）混合后放置于1.5 mL離心管中，2 000 r/min離心5 min收集菌體；加入0.6 mol/L KCl-0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗菌體2次；加入35% PEG4000-50 mmol/L CaCl2溶液，懸浮菌體，并于30℃靜置1 h后，2 000 r/min離心5 min收集菌體；將菌體懸浮于0.6 mol/L KCl-0.1 mol/L磷酸緩沖液中；取懸浮液稀釋后涂布到MM平板上，于30℃培養2-3 d，從長出的菌落中篩選出同時具有絮凝性，耐酸能力且發酵性能最佳的融合子。

1.2.4 菌株的性能評價

1.2.4.1 絮凝性評價 將菌株接種至2% YPDU培養基（pH自然）中培養16 h。分別取5 mL菌體培養液于試管中，漩渦振蕩均勻，靜置不同時間后觀察菌株的絮凝性。

1.2.4.2 耐酸能力評價 （1）絮凝性酵母：取5 mL發酵液振蕩均勻，取出500 μL，加入適量0.1 mmol/L EDTA打散菌體，再加超純水稀釋至適當倍數，利用紫外分光光度計測定酵母濃度（OD660）；（2）非絮凝性酵母：將菌株接種至pH3.0和pH2.7的2% YPDU培養基中，并在35℃下于小型試管培養儀（ADVANTEC，日本）中培養，儀器自動記錄不同時間菌體生長的OD660值。

1.2.4.3 發酵性能評價 將菌株分別接種至2%YPDU培養基（pH自然）中，并于30℃，160 r/min預培養16 h。再按10%接種量接種至不同pH的15% YPDU培養基中發酵，定時取樣檢測總細胞數、葡萄糖濃度和乙醇濃度。菌株的性能評價實驗均重復3次。

1.2.5 化學分析 取5 mL發酵液于4℃、10 000 r/min條件下離心2 min，上清經0.45 μm的濾膜過濾，用于葡萄糖和乙醇濃度分析。利用LC-10AD VP高效液相色譜儀（Shimadzu，日本）分析葡萄糖濃度，檢測器為RF-10AXL，爐溫為150℃，柱溫為65℃；利用GC 353B氣相色譜儀（GL sciences，日本）測定乙醇濃度，以異丙醇為內標，氦氣為載氣，氫氣為燃氣，爐溫為50℃，注射器和檢測器溫度均為180℃。

2 結果

2.1 營養缺陷型標記菌株的篩選

利用紫外誘變的方法獲得親本菌株的營養缺陷型標記菌株?？疾炝俗贤庹T變時間對菌株存活率的影響。圖1顯示，延長紫外誘變時間會降低菌株的細胞存活率。一般認為細胞存活率在20%-25%時獲得的突變菌株比較適合，可以保障菌株性能不受太大影響。因此，確定兩個親本菌株的最佳紫外誘變時間均為50 s。在該誘變條件下經過4次反復篩選驗證，最終獲得3株RHZ-1和5株SEB2的營養缺陷型標記菌株，每株挑選2個克隆，分別命名為 RHZ-A1（A2）、RHZ-B1（B2）、RHZ-C1（C2）；SEB-A1（A2）、SEB-B1（B2）、SEB-C1（C2）、SEB-D1（D2）和SEB-E1（E2）。

圖1 紫外誘變時間的優化

將上述16株突變菌株涂布到含不同營養物的MM平板上，通過其生長能力來鑒定營養缺陷類型（圖2）。RHZ-A1（A2）和SEB-D1（D2）為尿嘧啶缺陷型菌株（Ura-）；RHZ-B1（B2）為賴氨酸缺陷型菌株（Lys-）；RHZ-C1（C2）為半胱氨酸缺陷型菌株（Cys-）；SEB-B1（B2）為腺嘌呤缺陷型菌株（Ade-）；SEB-E1（E2）為組氨酸缺陷型菌株（His-）。而SEB-A1（A2）和SEB-C1（C2）在所有MM平板上均不生長，表明這4株菌為兩種或多種不同營養缺陷型菌株，無法用于原生質體融合的遺傳標記篩選，后續不再對其進行考察。

圖2 親本突變菌株的營養缺陷類型鑒定

2.2 營養缺陷型標記菌株的性能評價

對親本RHZ-1的營養缺陷型標記菌株進行了絮凝性測試，結果顯示所有突變菌株都具有良好的絮凝性?？疾炝诉@些菌株在35℃的耐酸能力。如圖3-A所示，在不同pH條件下，菌株RHZ-B1（B2）的生長能力與親本RHZ-1基本接近；在pH3.0條件下，菌株RHZ-A2的生長明顯優于親本菌株；酸性條件對菌株RHZ-C1（C2）的生長均存在抑制，菌株RHZ-C1的生長在pH2.7條件下被嚴重抑制。因此，選擇菌株RHZ-A2、RHZ-B2和RHZ-C2進行發酵實驗篩選。發酵結果（圖4）顯示，菌株RHZ-B2（Lys-）具有較高的發酵性能，其在細胞生長、乙醇產生量、葡萄糖消耗方面，均接近出發菌株RHZ-1。因此，選擇RHZ-B2（Lys-）作為后續原生質體融合的親本菌株。

以出發菌株SEB2作為對照，比較不同pH條件下營養缺陷型標記菌株間的OD660、最大生長速率μmax（h-1），以及OD660達到0.5所需時間tOD660=0.5（min），以判斷各菌株的耐酸能力（圖3-B，C，D）?？梢钥闯?，在pH3.0和pH2.7條件下，只有菌株SEB-E1（E2）的生長能力接近親本菌株SEB2，其它菌株的生長均受到一定抑制；當pH為2.7時，抑制情況更加明顯。選擇菌株SEB-B2、SEB-D2、SEB-E2進行發酵實驗篩選。發酵結果（圖4）顯示，SEB-E2（His-）在細胞生長、乙醇產生量、葡萄糖消耗方面，均比另外兩個菌株具有更好的性能。因此，選擇SEB-E2（His-）作為后續原生質體融合的親本菌株。

2.3 原生質體細胞的融合

以菌株RHZ-B2（Lys-）和SEB-E2（His-）作為親本，進行原生質體細胞的融合?？疾炝私湍讣毎诹呀饷笣舛葘υ|體制備過程的影響。如表1所示，受試裂解酶濃度均可獲得100%的原生質體形成率，表明酵母細胞破壁較為理想，但對再生率的影響較大。酵母裂解酶濃度為0.025 mg/mL時，菌株RHZ-B2（Lys-）和SEB-E2（His-）可獲得最好的原生質體再生率，分別為4.0%和7.5%，有利于下一步融合。

圖3 酸性條件下親本營養缺陷型菌株的生長能力評價（35℃，2%YPDU）

圖4 親本營養缺陷型菌株的發酵能力評價（35℃，15% YPDU，pH2.7）

表1 酵母裂解酶濃度對原生質體制備的影響

2.4 原生質體融合菌株的評價

將融合后的菌懸浮液涂布到平板上，對長出的融合子進行篩選，共獲得16株融合子，命名為RS-1-RS-16?？疾炝巳诤暇甑男跄?，結果顯示所有融合菌株RS均具有與親本RHZ-1同等程度的絮凝性。在30℃，pH2.2，15%YPD條件下的發酵結果（圖5）顯示，融合菌株RS-1、RS-6及RS-10的葡萄糖消耗速率及乙醇產生量均優于親本RHZ-1，其中菌株RS-1的發酵性能最佳。發酵24 h時，菌株RS-1的殘糖量為31.88 g/L［糖消耗速率為4.9 g/（L·h）］，乙醇產生量為47.87 g/L，基于糖消耗的乙醇收率為0.41 g/g；親本RHZ-1殘糖量為52.7 g/L［糖消耗速率為4.1 g/（L·h）］，乙醇產生量為35.93 g/L，基于糖消耗的乙醇收率為0.37 g/g。與RHZ-1相比，RS-1的糖消耗速率和乙醇收率分別提高了19.5%和9.8%。

圖5 30℃條件下融合菌株的發酵能力評價（15% YPDU，pH 2.2）

進一步比較了融合菌株在更高溫度（35℃）條件下的發酵能力。如圖6所示，與親本RHZ-1相比，融合菌株在高溫下的耐酸性能大大提高，菌株RS-1的發酵性能仍然最佳。發酵48 h時，融合菌株RS-1的殘糖量為48.04 g/L［糖消耗速率為2.1 g/（L·h）］，乙醇產生量為38 g/L，基于糖消耗的乙醇收率為0.37 g/g。親本RHZ-1的殘糖量為81.3 g/L［糖消耗速率為1.43 g/（L·h）］，乙醇產生量為20.07 g/L，基于糖消耗的乙醇收率為0.29 g/g。與RHZ-1相比，RS-1的糖消耗速率和乙醇收率分別提高了46.8%和21.6%。因此，本研究以絮凝性菌株RHZ-1和耐酸性菌株SEB2為出發菌株，通過原生質體細胞融合，最終獲得一株兼有雙親遺傳性狀，且具有優秀乙醇發酵性能的耐酸絮凝性釀酒酵母菌株RS-1。

圖6 35℃條件下融合菌株的發酵能力評價（15% YPDU，pH 2.2）

3 討論

釀酒酵母是乙醇生產中最常用的發酵菌株。在實際的乙醇生產工藝中，木質纖維素原料的預處理以及雜菌污染的控制過程均會降低發酵體系的pH值［4］。如巴西的乙醇生產過程中，酵母細胞需經pH2.0-2.5的稀硫酸洗滌1-2 h以去除雜菌污染，再返回到發酵池進行重復發酵［11］。但釀酒酵母在低pH值下往往難以維持較高的存活率及發酵性能，尤其在其它脅迫壓力（如高溫、高糖、高乙醇濃度等）共存時情況會更加嚴峻［12］。因此，同時擁有多種優良性狀的釀酒酵母在提高乙醇產量及降低發酵成本方面更具有應用前景。

釀酒酵母對環境壓力的耐受原理非常復雜，耐酸及耐溫機制尚不清楚。全基因組表達分析顯示約2/3的酵母基因參與環境脅迫的應答機制，且不同菌株之間的響應區別較大［13，14］。因此，傳統的育種技術如物理化學突變、原生質體融合、基因組改組等更適用于遺傳背景不清楚的工業酵母的育種，尤其適于多種優良性狀菌株的整合。潘靜等［15］利用紫外誘變和3輪原生質體融合技術相結合的方法，有效選育出能同時耐受48℃，19% vol乙醇和pH2.6的高產酵母菌株。Mitsumasu等［16］和Benjaphokee等［17］分別利用交配的方法獲得了釀酒酵母二倍體菌株，它們在41℃、pH3.5條件下的乙醇產量比原始菌株均有提高。關妮等［18］通過雙親滅活的原生質體融合技術，獲得一株耐受高濃度乙醇的絮凝性釀酒酵母。但乙醇工業上真正具有多種優良性狀的菌株仍然較少。

本研究以絮凝性釀酒酵母RHZ-1及耐酸耐溫釀酒酵母SEB2為親本，應用原生質體融合技術，獲得一株優秀的耐酸絮凝性釀酒酵母菌株RS-1。由于現有研究多采用不同選育方法獲得有機酸耐受釀酒酵母（如甲酸、乙酸等），而對耐受低pH無機酸的相關報道有限，因此可用于與本研究獲得的菌株進行比較的同類菌株很少［19］。Ortiz-Mu?iz等［20］從糖蜜發酵液中分離出性能優良的野生菌株ITV-01，在30℃、pH2.5條件下利用15% YPD發酵，發酵36 h后殘糖量為72.2 g/L，乙醇收率為0.39 g/g。而本研究獲得的菌株RS-1，在30℃、pH2.2條件下利用15% YPD發酵，24 h后的殘糖量僅為31.88 g/L，乙醇收率為0.41 g/g。且菌株ITV-01在溫度高于35℃、pH低于3.5的條件下難以生長，表明其無法耐受高溫及低pH值的協同壓力。本實驗室前期通過逐步降低發酵體系pH長期馴化的方式，獲得了一株耐酸性能優良的釀酒酵母SCiK12-BC4［21］。在35℃，pH2.5條件下利用15%YPD發酵48 h后，SCiK12-BC4基于糖消耗的乙醇收率（0.41 g/g）與菌株RS-1（35℃，pH2.2，0.37 g/g）接近。但整個過程耗時，工作量大，且耐酸能力不如菌株RS-1。原生質體融合技術具有在較短周期內選育優良菌株的優勢。對融合菌株RS-1進行了長期反復傳代培養（傳代34次），驗證了其耐酸性能的穩定性。此外，杜昭勵等［22］發現絮凝基因FLO1 及FLO1c 的高表達可有效提高工業釀酒酵母的乙酸耐受性及發酵性能。因此，今后將進一步探索以提高菌株RS-1的耐乙酸及耐溫性能，為燃料乙醇工業化生產提供優秀的多耐性微生物菌株資源。

4 結論

以絮凝性釀酒酵母RHZ-1及耐酸耐溫釀酒酵母SEB2為親本，通過原生質體融合技術選育出一株優秀的耐酸絮凝性釀酒酵母RS-1。發酵結果顯示，菌株RS-1在30℃及35℃的酸性條件下（pH2.2），均能高效發酵葡萄糖產乙醇，且該菌株的糖消耗速率和基于糖消耗的乙醇收率均比親本菌株RHZ-1有較大提高。結果表明原生質體融合技術是快速獲得耐酸絮凝性釀酒酵母的有效手段。

［1］ Morales M, Quintero J, Conejeros R, et al. Life cycle assessment of lignocellulosic bioethanol：Environmental impacts and energy balance［J］. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2015, 42：1349-1361.

［2］ Madhavan A, Srivastava A, Kondo A, et al. Bioconversion of lignocellulose-derived sugars to ethanol by engineered Saccharomyces cerevisiae［J］. Critical Reviews in Biotechnology, 2012, 32（1）：22-48.

［3］ Carrere H, Antonopoulou G, Affes R, et al. Review of feedstock pretreatment strategies for improved anaerobic digestion：From lab-scale research to full-scale application［J］. Bioresource Technology, 2016, 199：386-397.

［4］ Cotter PD, Hill C. Surviving the acid test：Responses of gram-positive bacteria to low pH［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2003, 67（3）：429-453.

［5］ Choi GW, Um HJ, Kang HW, et al. Bioethanol production by a flocculent hybrid, CHFY0321 obtained by protoplast fusion between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces bayanus［J］. Biomass and Bioenergy, 2010, 34（8）：1232-1242.

［6］ Zhao XQ, Bai FW. Yeast flocculation：New story in fuel ethanol production［J］. Biotechnology Advances, 2009, 27（6）：849-856.

［7］ 胡純鏗, 白鳳武, 安利佳. 絮凝特性對自絮凝顆粒酵母耐酒精能力的影響及作用機制［J］. 生物工程學報, 2005, 21（1）：123-128.

［8］ 鞏繼賢, 鄭輝杰, 鄭宗寶, 等. 微生物進化工程育種技術進展與展望［J］. 生物加工過程, 2010, 8（2）：69-76.

［9］ 趙春苗, 徐春厚. 原生質體融合技術及在微生物育種中的應用［J］. 中國微生態學雜志, 2012, 24（4）：379-382.

［10］ 葉世超, 薛婷, 王曉斐, 等. 釀酒酵母耐高溫提高技術的研究進展［J］. 中國農學通報, 2013, 29（21）：126-130.

［11］ Bassi AP, da Silva JC, Reis VR, et al. Effects of single and combined cell treatments based on low pH and high concentrations of ethanol on the growth and fermentation of Dekkera bruxellensis and Saccharomyces cerevisiae［J］. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2013, 29（9）：1661-1676.

［12］ de Melo HF, Bonini BM, Thevelein J, et al. Physiological and molecular analysis of the stress response of Saccharomyces cerevisiae imposed by strong inorganic acid with implication to industrial fermentations［J］. Journal of Applied Microbiology, 2010, 109（1）：116-127.

［13］ Causton HC, Ren B, Koh SS, et al. Remodeling of yeast genome expression in response to environmental changes［J］. Molecular Biology of the Cell, 2001, 12（2）：323-337.

［14］ Garay-Arroyo A, Covarrubias AA, Clark I, et al. Response to different environmental stress conditions of industrial and laboratory Saccharomyces cerevisiae strains［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2003, 63（6）：734-741.

［15］ 潘靜, 王昌祿, 李風娟, 等. 多耐性酒精酵母菌的選育及特性研究［J］. 中國釀造, 2011, 30（5）：113-116.

［16］ Mitsumasu K, Liu ZS, Tang YQ, et al. Development of industrial yeast strain with improved acid- and thermo-tolerance through evolution under continuous fermentation conditions followed by haploidization and mating［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2014, 118（6）：689-695.

［17］ Benjaphokee S, Hasegawa D, Yokota D, et al. Highly efficientbioethanol production by a Saccharomyces cerevisiae strain with multiple stress tolerance to high temperature, acid and ethanol［J］. New Biotechnology, 2012, 29（3）：379-386.

［18］ 關妮, 楊登峰, 米慧芝, 等. 多優良性狀工業化釀酒酵母的選育及其特性研究［J］. 中國釀造, 2010, 29（9）：45-48.

［19］ Sanda T, Hasunuma T. Repeated-batch fermentation of lignocellulosic hydrolysate to ethanol using a hybrid Saccharomyces cerevisiae strain metabolically engineered for tolerance to acetic and formic acids［J］. Bioresource Technology, 2011, 102（17）：7917-7924.

［20］ Ortiz-Mu?iz B, Carvajal-Zarrabal O, Torrestiana-Sanchez B, et al. Kinetic study on ethanol production using Saccharomyces cerevisiae ITV-01 yeast isolated from sugar cane molasses［J］. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2010, 85（10）：1361-1367.

［21］ 羅珠, 湯岳琴, 孫照勇, 等. 基于連續發酵馴化的耐酸性釀酒酵母的育種［J］. 四川大學學報：自然科學版, 2014, 51（4）：821-828.

［22］ 杜昭勵, 程艷飛, 朱卉, 等. 絮凝基因FLO1及FLO1c高表達提高工業釀酒酵母乙酸耐受性及發酵性能［J］. 生物工程學報, 2015, 31（2）：231-241.

（責任編輯 馬鑫）

Construction of Acid-tolerant and Flocculating Saccharomyces cerevisiae Strain for Ethanol Production by Protoplast Fusion

GOU Min YANG Bai-xue TANG Yue-qin Kida Kenji
（Sichuan University，College of Architecture and Environment，Chengdu 610065）

In order to obtain an excellent strain with multi traits for ethanol production，using flocculating strain RHZ-1 and acid-tolerant strain SEB2 as the parents，auxotrophic strains were obtained by UV mutagenesis induction. Saccharomyces cerevisiae strain RS-1 with excellent acid-tolerant and flocculating ability was selected by screening fusants with the technology of protoplast fusion. When fermenting 15% YPD at 30℃ and pH2.2 for 24 h，the ethanol yield was 47.87 g/L，the glucose consumption rate and ethanol yield of strain RS-1 was greatly improved compared to the original strain RHZ-1，increased 19.5% and 9.8%，respectively. When fermenting 15% YPD at 35℃ and pH2.2 for 48 h，the ethanol yield was 38 g/L，the glucose consumption rate and ethanol yield of strain RS-1 increased 46.8% and 21.6%，respectively compared to the original strain RHZ-1. The results suggest that the strain obtained in this study could be a potential microorganism for ethanol industry.

Saccharomyces cerevisiae；UV mutagenesis；protoplast fusion；acid tolerance；ethanol fermentation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.013

2016-03-30

茍敏，女，博士，碩士生導師，研究方向：有機廢棄物資源化；E-mail：gouminscu@163.com

湯岳琴，女，教授，博士生導師，研究方向：有機廢棄物資源化；E-mail：tangyq@scu.edu.cn