花粉介導(dǎo)法獲得耐草甘膦玉米植株及其耐性研究

楊慧珍任志強(qiáng)肖建紅卜華虎劉惠民

（1. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，太原 030031；2. 農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031）

花粉介導(dǎo)法獲得耐草甘膦玉米植株及其耐性研究

楊慧珍1，2任志強(qiáng)2肖建紅2卜華虎2劉惠民2

（1. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，太原 030031；2. 農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031）

為獲得耐草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米植株，進(jìn)而研究其除草劑耐性及外源基因的遺傳特性，以質(zhì)粒pBI101-aroA-M12為外源基因供體，以玉米自交系昌‘7-2’為受體，采用花粉介導(dǎo)法將外源基因?qū)胗衩鬃越幌抵小CR擴(kuò)增、Southern雜交分析的結(jié)果證明獲得了54個(gè)轉(zhuǎn)基因植株；對(duì)其后代株系的分子檢測(cè)及田間生物學(xué)鑒定，結(jié)果證明目的基因可以穩(wěn)定遺傳給后代植株，且賦予和提高了轉(zhuǎn)基因植株的除草劑耐性。目的基因在轉(zhuǎn)化體中的遺傳規(guī)律研究，結(jié)果顯示導(dǎo)入的目的基因在F2受體植株中以3∶1的比例發(fā)生遺傳分離，符合孟德?tīng)枂我蜃语@性遺傳分離規(guī)律。ELISA分析和蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的結(jié)果證實(shí)目的基因在轉(zhuǎn)化植株中得到表達(dá)，表達(dá)量介于40.5-112.6 ng/g 葉片鮮重之間，目的基因表達(dá)量與該植株的除草劑耐性性狀間呈極顯著相關(guān)，r=0.942 3（P＜0.01）。最終研究獲得了4個(gè)高草甘膦耐性的轉(zhuǎn)基因純合株系。

玉米；aroA-M12基因；草甘膦耐性；花粉介導(dǎo)；遺傳分析

中國(guó)是世界上位居第二的玉米（Zea mays L.）生產(chǎn)大國(guó)，年玉米種植面積3 000多萬(wàn)hm2，玉米產(chǎn)量達(dá)億余噸，占世界上玉米總產(chǎn)量的20%。即便如此，從2009年開(kāi)始，我國(guó)還是成為玉米的凈進(jìn)口國(guó)。2013年我國(guó)玉米產(chǎn)量雖高達(dá)2.13億t，但玉米進(jìn)口量也提高到500萬(wàn)t，足見(jiàn)我國(guó)玉米市場(chǎng)的潛力以及這種潛力所形成的對(duì)玉米生產(chǎn)的壓力。誠(chéng)然我國(guó)玉米生產(chǎn)能力和水平都有大幅度提高，但影響和制約玉米生產(chǎn)的諸多因素依然存在，其中，雜草清除無(wú)疑是最令人困擾的環(huán)節(jié)之一。玉米田雜草種類(lèi)多、數(shù)量大，在整個(gè)玉米生產(chǎn)期都存在與玉米競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境資源、進(jìn)而影響玉米產(chǎn)量的現(xiàn)象。在我國(guó)廣大農(nóng)村，每年都要花費(fèi)很大的財(cái)力和人力來(lái)處理田間雜草，造成了資源的極大浪費(fèi)。隨著我國(guó)農(nóng)村深化改革步伐的加快，集約化、規(guī)模化的生產(chǎn)方式日趨可待，人工噴霧除草劑清理雜草的時(shí)代也將很快過(guò)去，因此培育適合農(nóng)田大規(guī)模、機(jī)械化噴施除草劑的玉米品種更顯得非常重要和十分迫切。

草甘膦是一種廣譜性除草劑，它的靶酶是位于質(zhì)體上5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS），其作用是阻斷氨基酸的合成，最終因營(yíng)養(yǎng)缺乏而導(dǎo)致雜草等死亡［1］。研究證明，草甘膦價(jià)格低廉，土壤吸附性強(qiáng)，對(duì)動(dòng)物無(wú)毒性，也無(wú)致畸、致癌及遺傳毒性，對(duì)雙子葉和單子葉，草本、木本灌木及喬木均有一定的防除效果［2］。將編碼EPSPS的aroA基因突變并導(dǎo)入生物體，可使植物或細(xì)菌獲得對(duì)草甘膦的耐性［3-7］。

目前應(yīng)用較多的CP4-ESPSPS抗草甘膦基因來(lái)源于土壤農(nóng)桿菌CP4株系［8］，自1996年成功培育出了第一批耐草甘膦的耐除草劑作物后［9］，相關(guān)研究有了很大發(fā)展。國(guó)外Sidhu 等［10］利用對(duì)草甘膦不敏感的CP4 基因轉(zhuǎn)化玉米，獲得了耐草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米并投入商業(yè)化生產(chǎn)；接著耐草甘膦基因在玉米［11］、大豆［12］、苜蓿［13］、油菜［14］、甜菜［15］、煙草［16］、小麥［17］、棉花［18］等作物上也轉(zhuǎn)化成功。國(guó)內(nèi)，謝龍旭等［19］構(gòu)建了含草甘膦耐性突變基因（aroA-M12）的植物表達(dá)載體pCM12-s1m，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到煙草中，經(jīng)篩選獲得了轉(zhuǎn)基因煙草，對(duì)草甘膦有較強(qiáng)的耐性；Tong等［20］通過(guò)在體外培養(yǎng)基中逐漸增加草甘膦濃度的離體篩選到耐草甘膦幼苗；余桂榮等［21］利用玉米胚型愈傷組織獲得了對(duì)草甘膦具有一定耐性的突變體植株；赫福霞等［22］通過(guò)基因槍轟擊，將構(gòu)建的pMAGUHM 載體（其上攜帶有耐草甘膦基因2mG2-epsps 基因）轉(zhuǎn)化到玉米愈傷組織，利用草甘膦篩選得到耐草甘膦植株80 株，其中PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株為36 株，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率為45%。綜上所述，轉(zhuǎn)耐草甘膦作物研究在國(guó)內(nèi)起步早，且取得了較大進(jìn)展。但轉(zhuǎn)化過(guò)程多采用國(guó)內(nèi)外通用的基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等，應(yīng)用具有國(guó)內(nèi)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)化方法和耐草甘膦基因的報(bào)道還較少。

基于以上原因，本研究采用的轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)化用目的基因均具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，即利用花粉介導(dǎo)法［23］將耐草甘膦基因aroA-M12導(dǎo)入玉米自交系‘昌7-2’，期望得到耐草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因玉米植株，并能篩選到目的基因高效表達(dá)、草甘膦耐性提高的轉(zhuǎn)基因純合株系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)植物材料為改良玉米自交系‘昌7-2’（本實(shí)驗(yàn)室保存）。該材料具有配合力強(qiáng)、抗病抗蟲(chóng)等特點(diǎn)，適合作為玉米制種親本廣泛應(yīng)用。

1.1.2 質(zhì)粒 供試質(zhì)粒為帶有耐草甘膦基因的植物表達(dá)載體pBI101-aroA-M12，CaMV35S啟動(dòng)子和nosT終止子調(diào)控目的基因aroA-M12（由中山大學(xué)生物工程中心提供）的表達(dá)，宿主菌為大腸桿菌（E. coli）菌株DH5α。圖1是質(zhì)粒pBI101-aroA-M12的物理圖譜。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)化方法

1.2.1.1 質(zhì)粒DNA的提取 質(zhì)粒DNA按《分子克隆》中堿解法提取［24］。

1.2.1.2 花粉介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)［23］并略有改進(jìn)。稱(chēng)取一定重量的新鮮取回的花粉立刻置于預(yù)先加入預(yù)冷的15%蔗糖溶液的平底試管中，做第一次超聲波處理，此處理的目的使花粉表面的核酸酶失活，并使花粉處于感受態(tài)。按1∶50 000的比例加入質(zhì)粒DNA，并在溶液中加入少量的硼酸（50 mg/L）、GA3（40 mg/L）以促進(jìn)花粉在授粉后的萌發(fā)。進(jìn)行第二次超聲波處理；最后，將處理好的花粉快速授粉于預(yù)先套袋并已剪去大部分花絲的雌穗花絲上，套袋，秋后收獲種子（T0種子）。

圖1 質(zhì)粒pBI101-aroA-M12的物理圖譜

1.2.1.3 田間播種 2009年，T0代種子263粒全部播種，4葉期全部取樣進(jìn)行PCR檢測(cè)，并對(duì)PCR檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果材料做Southern雜交分析，Southern雜交陽(yáng)性結(jié)果植株自交授粉收獲T1代種子54穗，依次標(biāo)記為T(mén)1-1、T1-2 … T1-54；2010年，T1代收獲的54穗種子各播種5行得T2植株，每5行為一個(gè)株系，分別標(biāo)記為T(mén)2-1、T2-2 … T2-54，花期選擇分子檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性、生長(zhǎng)健壯、且其它農(nóng)藝性狀優(yōu)良的10個(gè)株系（T2-2、T2-8、T2-9、T2-16、T2-21、T2-24、T2-33、T2-37、T2-43、T2-49）套袋自交收獲T2種子；2011年，所選T2代10個(gè)株系按各播種5個(gè)株系得到T3代植株，每株系5行，按T2代標(biāo)號(hào)從小到大順序分別標(biāo)記為T(mén)3-1-1、T3-1-2 T3-1-3 T3-1-4 T3-1-5 T3-2-1… T3-10-5，得T3代植株并收獲T3種子；

2012年，播種來(lái)自T3代種子（T3-3-1、T3-3-2、T3-3-3、T3-3-4、T3-3-5均來(lái)自T1-9）各2個(gè)株系，每株系5行，以得到的T4植株做父本，以非轉(zhuǎn)化‘昌7-2’植株做母本，雜交得到F1雜種；2013年F1雜種播種250行。

1.2.2 轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)

1.2.2.1 植物DNA提取 所有樣品按CTAB方法［25］提取植物DNA。

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增引物，上游引物：ATGCCATGGAATCCCTGACGTTACAA，下游引物：GCGGATCCTTAGCAGGCTACTCATTC，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為1 000 bp。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。擴(kuò)增體系20 μL，擴(kuò)增反應(yīng)：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，55℃退火90 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離并照相。

1.2.2.3 Southern雜交分析 Southern blot雜交基本參照文獻(xiàn)［24］的方法，每個(gè)樣品25 μg 總DNA 分別用EcoRⅠ單酶切或Hind Ⅲ和SalⅠ雙酶切，完全酶切后，酶切產(chǎn)物分別在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳過(guò)夜，然后毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。雜交探針用Roch公司生產(chǎn)的地高辛標(biāo)記，按PCR擴(kuò)增方法制備，雜交產(chǎn)物用CSPD顯影照相。

1.2.2.4 ELISA檢測(cè) 試驗(yàn)用試劑盒為Quantiplate ELISA kit for CP4 EPSPS。樣品按試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行逐步操作，并在酶標(biāo)儀上讀取各反應(yīng)液的吸光值，最后計(jì)算出每克樣品鮮重中目的基因的表達(dá)量。試驗(yàn)設(shè)兩次重復(fù)。

1.2.3 田間生物學(xué)鑒定 T3代植株5葉期，用0.25%的除草劑Roundup 噴灑轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株，7 d 后同濃度重復(fù)噴霧一次。再過(guò)7 d進(jìn)行田間調(diào)查。調(diào)查指標(biāo)包括：受害植株數(shù)、受害程度，調(diào)查對(duì)象：T3代 材 料T3-1-1、T3-2-1、T3-3-1、T3-4-1、T3-5-1、T3-6-1、T3-7-1、T3-8-1、T3-9-1、T3-10-1共10個(gè) 株系以及1個(gè)對(duì)照株系（除草劑傷害嚴(yán)重但尚未死亡株），同時(shí)對(duì)這些材料做ELISA雜交分析并測(cè)定各植株中目的基因表達(dá)量。

植株受害程度的指標(biāo)，1級(jí)：無(wú)傷害或個(gè)別葉片有輕度傷害（傷害面積占該葉片的30%以下）；2級(jí)：下部葉片有中度傷害（傷害面積占這些葉片面積的50%-80%），且在2周后傷害程度有所減緩；3級(jí)：下部葉片有中度傷害（傷害面積占這些葉片面積的50%-80%）或整株受傷害，隨后死亡。

株系耐除草劑等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：高耐：除草劑耐性0-5%；耐：5.1%-40%；低耐：40.1%-70%；敏感：＞70.1%。

根據(jù)各個(gè)株系植株除草劑耐性標(biāo)準(zhǔn)分為敏感、低耐、耐性、高耐4個(gè)區(qū)間，計(jì)算各個(gè)區(qū)間所有植株的除草劑耐性平均值，由于植株除草劑耐性越高，其受害程度越低，其除草劑耐性值也越低，為了使除草劑抗性性狀與蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)，可用100%-該區(qū)間除草劑耐性值，所得數(shù)值用作該區(qū)間數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析，計(jì)算公式如下：

利用2007版Excel統(tǒng)計(jì)分析工具進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 目的基因遺傳規(guī)律分析 （1）目的基因遺傳分離分析：在T2代試驗(yàn)田，如1.2.1.3取10個(gè)株系的全部樣品，進(jìn)行PCR檢測(cè)；每個(gè)株系隨機(jī)取樣6份，進(jìn)行ELISA雜交分析，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果做目的基因分離分析。（2）目的基因世代遺傳和表達(dá)分析：根據(jù)PCR檢測(cè)、Southern雜交分析、ELISA雜交分析結(jié)果以及田間生物學(xué)鑒定結(jié)果，分析和評(píng)估目的基因在轉(zhuǎn)化植株后代中的世代遺傳現(xiàn)象和表達(dá)規(guī)律。

圖2 T3代部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)化植株的獲得及各代分子檢測(cè)結(jié)果

共轉(zhuǎn)化雌穗349個(gè)，收獲T0種子263粒（轉(zhuǎn)化雌穗空穗率較多，結(jié)實(shí)雌穗的結(jié)實(shí)率也僅為1-3粒/穗）。來(lái)年播種，出苗239株（T1），PCR檢測(cè)得到陽(yáng)性植株97株，進(jìn)一步Southern雜交分析，得到轉(zhuǎn)化植株54株，轉(zhuǎn)化率為22.6%。T2代54個(gè)株系的PCR檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果率為72.4%，T3代10個(gè)株系中PCR陽(yáng)性結(jié)果植株數(shù)達(dá)到98.5%，T2代270份材料和T3代250份材料的Sothern雜交結(jié)果均為陽(yáng)性，F(xiàn)1代植株的PCR擴(kuò)增和Southern雜交結(jié)果均為陽(yáng)性。結(jié)果顯示目的基因已導(dǎo)入‘昌7-2’植株并整合到受體基因組中，而且目的基因可以隨材料穩(wěn)定遺傳且轉(zhuǎn)基因材料的穩(wěn)定性也在逐代提高。

圖2是部分T3轉(zhuǎn)基因植株的PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果，陰性對(duì)照未出現(xiàn)特異條帶，轉(zhuǎn)基因植株均擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照預(yù)期大小一致的特異條帶。圖3是部分T1和T3代植株的Southern雜交分析結(jié)果。圖3-A中2、4、5、6泳道（對(duì)應(yīng)T1代材料T5、T6、T8、T9）顯示一條雜交帶，1、3泳道出現(xiàn)2條或以上個(gè)雜交條帶（被淘汰），7泳道未發(fā)現(xiàn)雜交條帶（淘汰）；圖3-B中除陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照外，其余材料均來(lái)自T9轉(zhuǎn)化事件，且其DNA均經(jīng)受雙酶酶切，所以雜交條帶的大小均與陽(yáng)性對(duì)照（質(zhì)粒DNA）一致，其中陽(yáng)性對(duì)照上樣量為2 μL，根據(jù)雜交條帶的大小和豐度分析，證明目的基因絕大部分是以單拷貝數(shù)、單位點(diǎn)整合進(jìn)轉(zhuǎn)化植株的染色體基因組中的。

圖3 轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交結(jié)果

2.2 T3代轉(zhuǎn)基因植株ELISA分析及蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果

60份T3代植株材料的ELISA檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，證明目的基因能夠穩(wěn)定表達(dá)。同時(shí)其蛋白質(zhì)濃度測(cè)定結(jié)果也表明，所有被測(cè)定的轉(zhuǎn)基因植株中，aroA-M12基因都得到表達(dá)。部分材料的蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，表中蛋白含量數(shù)據(jù)均為2次重復(fù)的平均值。從表1中可以看出，不同植株間目的基因表達(dá)量存在差異，變化幅度介于40.5-112.6 ng/g葉片鮮重之間；不同轉(zhuǎn)化事件間目的基因表達(dá)量也有較大變化，T1-37轉(zhuǎn)化事件的目的蛋白濃度的平均值最高，達(dá)到87 ng/g 葉片鮮重以上。

表1 部分T3植株的aroA-M12蛋白測(cè)定結(jié)果

2.3 目的基因的遺傳分離及世代遺傳和表達(dá)規(guī)律

2.3.1 目的基因遺傳分離規(guī)律 轉(zhuǎn)化材料中目的基因在T2代發(fā)生了遺傳分離，在對(duì)如表2所示的10個(gè)株系進(jìn)行的遺傳分離研究中，PCR檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果率為72.4%，分離比為2.63∶1（χ2=2.000）；ELISA檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率為71.7%（43/60），分離比2.53∶1（χ2=0.356），與PCR檢測(cè)結(jié)果一致。χ2測(cè)驗(yàn)結(jié)果證明目的基因的遺傳分離符合3∶1 的孟德?tīng)枂我蜃舆z傳規(guī)律，達(dá)到顯著水平，即在玉米遺傳背景下目的基因表現(xiàn)為單因子顯性遺傳方式。同一轉(zhuǎn)化事件或不同轉(zhuǎn)化事件間的后代植株，其遺傳分離現(xiàn)象基本一致。

2.3.2 目的基因世代遺傳規(guī)律和表達(dá)分析 轉(zhuǎn)化材料的多代連續(xù)分子檢測(cè)結(jié)果證明目的基因能夠隨轉(zhuǎn)化材料的世代遺傳而穩(wěn)定遺傳給下一代植株并在轉(zhuǎn)化植株中得到表達(dá)。此外，各代材料的PCR檢測(cè)、Southern雜交分析以及ELISA分析結(jié)果均顯示隨著世代交替，檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性率逐代提高，如PCR檢測(cè)T2代陽(yáng)性結(jié)果率為72.4%，T3代達(dá)到98.5%（表2）；ELISA分析T2代陽(yáng)性結(jié)果率為71.7%（表3），T3代ELISA檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性；Southern雜交分析T2、T3代的樣品結(jié)果均為陽(yáng)性。檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率的提高有利于轉(zhuǎn)基因純合株系的篩選，本研究在T3代獲得轉(zhuǎn)基因純合株系。T3代10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，來(lái)自T2-9的株系的aroA-M12基因表達(dá)量最低，平均值僅為61 ng/g，來(lái)自T2-49的株系的aroA-M12基因表達(dá)量最高，平均值為88 ng/g，而來(lái)自T2-8、T2-23和T2-37的3個(gè)株系的蛋白表達(dá)量平均值分別82.6、80.4和85.2 ng/g，單株轉(zhuǎn)化材料中目的基因表達(dá)量介于40.5-112.6 ng/g 葉片鮮重之間，存在顯著差異，這可能與植株個(gè)體差異有關(guān)。

表2 T2代轉(zhuǎn)基因植株中目的基因遺傳分離分析和χ2檢驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合田間除草劑耐性調(diào)查結(jié)果，各個(gè)轉(zhuǎn)化株系的除草劑耐性與該株系中目的基因表達(dá)水平有關(guān)，如T2-8、T2-23、T2-37和T2-49四個(gè)株系的除草劑耐性值均為高耐水平，其目的基因表達(dá)水平也最高，而除草劑耐性較低的T2-9株系，其蛋白表達(dá)水平也最低。田間噴霧除草劑（連續(xù)兩次）試驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，轉(zhuǎn)化株系的除草劑耐受性可達(dá)0.25%-0.5%左右。此外，根據(jù)aroA-M12基因的分子檢測(cè)及其田間除草劑耐性鑒定結(jié)果，證實(shí)已檢測(cè)轉(zhuǎn)化植株及其后代株系中不存在基因沉默現(xiàn)象，但存在為數(shù)較少的基因丟失現(xiàn)象，如在對(duì)T3代株系的檢測(cè)中，偶爾會(huì)發(fā)現(xiàn)某個(gè)株系的一些植株丟失了目的基因，在后續(xù)的研究中將對(duì)基因丟失現(xiàn)象和原因作進(jìn)一步探討。

表3 T2代、T3代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果

圖4 噴霧除草劑后田間轉(zhuǎn)基因植株的部分照片

F1代植株取樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增、Southern雜交和ELISA分析，所有檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，證明F1代植株含有aroA-M12基因，進(jìn)而證明目的基因可以通過(guò)雜交形式（本研究中轉(zhuǎn)基因植株作為父本）傳遞給下一代植株。

2.4 轉(zhuǎn)化植株的草甘膦耐性

T3代轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株噴霧除草劑的調(diào)查顯示，10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，高耐株系4個(gè)，耐性株系5個(gè)，低耐株系1個(gè)，不耐株系0個(gè)（表4）。所有對(duì)照植株在噴霧20 d后全部死亡。證明aroA-M12基因的導(dǎo)入和表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株的除草劑耐性。

通過(guò)對(duì)來(lái)自同一轉(zhuǎn)化事件后代不同植株對(duì)草甘膦的耐性及其該植株中目的基因表達(dá)量的相關(guān)分析，結(jié)果顯示除草劑耐性性狀與目的基因表達(dá)量間的相關(guān)性達(dá)極顯著水平，相關(guān)系數(shù)為r = 0.942 3（P＜0.01），即aroA-M12基因表達(dá)量與轉(zhuǎn)基因植株的除草劑耐性呈極顯著相關(guān)。此外對(duì)于來(lái)自不同轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因材料做相同的分析，結(jié)果顯示各事件后代植株的草甘膦耐性平均值與其株系中目的基因表達(dá)量的平均值間的相關(guān)系數(shù)r 介于0.841 6-0.961 4（P＜0.05），也呈顯著相關(guān)。

通過(guò)分析檢測(cè)和田間調(diào)查篩選，最終得到4個(gè)轉(zhuǎn)基因純合株系，T2-8、T2-23、T2-37和T2-49，其除草劑耐性平均值高于80 ng/g葉片鮮重，但得到的這4個(gè)T3代轉(zhuǎn)基因純合株系中，我們發(fā)現(xiàn)仍有一些植株中目的基因的表達(dá)量在50 ng/g葉片鮮重或以下，這些植株對(duì)草甘膦除草劑的耐受性也偏低，植株有不同程度的除草劑損傷，全面接受這些材料會(huì)在今后的生產(chǎn)中引發(fā)因除草劑的傷害而影響作物產(chǎn)量，因此在轉(zhuǎn)基因純合株系中篩選目的基因表達(dá)量較高的植株并進(jìn)一步研究其后代中目的基因表達(dá)水平至關(guān)重要，以期得到目的基因表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因純合株系。本研究證明，當(dāng)目的基因表達(dá)量高于70 ng/g鮮重時(shí)，噴灑0.25%的除草劑Roundup（噴灑兩次）對(duì)植株不造成傷害。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用耐草甘膦基因轉(zhuǎn)化玉米自交系獲得轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、Southern blot雜交分析的結(jié)果證明，目的基因確已導(dǎo)入到玉米自交系昌7-2中。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行ELISA分析的結(jié)果表明，目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中得到了表達(dá)。田間噴霧草甘膦鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)草甘膦具有明顯的耐性；不同轉(zhuǎn)化單株之間耐性的強(qiáng)弱有所不同。轉(zhuǎn)基因植株生物耐性鑒定結(jié)果說(shuō)明，由aroA-M12基因編碼的EPSPS蛋白在植物中的表達(dá)，確實(shí)能使轉(zhuǎn)基因植物具有耐草甘膦功能。最終獲得了4個(gè)高耐草甘膦的轉(zhuǎn)基因株系。為進(jìn)一步選育具有耐除草劑功能的玉米新品種奠定了良好的基礎(chǔ)。

有關(guān)目的基因在轉(zhuǎn)化植物中的遺傳規(guī)律，Peng等［26］將gusA和neo基因?qū)胨荆銻1代中這兩個(gè)基因的表型分離系數(shù)為3∶1，同孟德?tīng)柕膯蝹€(gè)顯性基因的分離規(guī)律一致；Cheng等［27］研究認(rèn)為外源基因在轉(zhuǎn)基因小麥中呈現(xiàn)3：1分離；本研究結(jié)果也證明，外源基因在F2代轉(zhuǎn)基因玉米中表現(xiàn)出3∶1的遺傳分離規(guī)律。不過(guò)也有研究認(rèn)為，外源基因在轉(zhuǎn)化植物中表現(xiàn)出背離3∶1的分離現(xiàn)象［28］，證明外源基因在轉(zhuǎn)化體中的整合方式和整合位點(diǎn)是很復(fù)雜的，多拷貝、多位點(diǎn)整合的轉(zhuǎn)化體是很難存在和應(yīng)用的，因此植物轉(zhuǎn)基因研究除了研究轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因外，提高目的基因以單拷貝、單位點(diǎn)整合到植物染色體組的轉(zhuǎn)化方法的研究也是十分必要的。幸運(yùn)的是，目前轉(zhuǎn)基因研究證明大部分轉(zhuǎn)化植物的遺傳分離是符合孟德?tīng)柕倪z傳分離規(guī)律的。關(guān)于外源基因的世代遺傳，本研究和其它研究［29-31］已證明目的基因是可以穩(wěn)定遺傳給下一代的，目的基因多以單拷貝、單位點(diǎn)形式插入受體基因組中；本研究與其它研究［32］還證明轉(zhuǎn)化體中的外源基因可以通過(guò)雜交傳遞給下一代。

表4 T3代植株除草劑耐性性狀與目的基因表達(dá)量相關(guān)性分析

不過(guò)，在隨后的分析中發(fā)現(xiàn)，同一轉(zhuǎn)化事件內(nèi)不同株系間目的基因表達(dá)量以及對(duì)除草劑耐性的差異主要起因于植株個(gè)體的差異；不同轉(zhuǎn)化事件間相關(guān)系數(shù)值、目的基因表達(dá)量以及其植株的除草劑耐性值的差異，除不同轉(zhuǎn)化事件的差異外，也與植株個(gè)體的差異有關(guān)，而植株個(gè)體的差異又多表現(xiàn)在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，目的基因插入的拷貝數(shù)和位點(diǎn)的差異，顯然目的基因拷貝數(shù)的多少、插入位點(diǎn)的效應(yīng)，都影響著目的基因在轉(zhuǎn)化體中的表達(dá)水平，特別是目的基因插入的拷貝數(shù)影響較大。本研究雖然通過(guò)Southern分析淘汰了部分多拷貝、多位點(diǎn)插入的轉(zhuǎn)化事件，但仍無(wú)法精準(zhǔn)地了解目的基因的插入拷貝數(shù)，其結(jié)果是對(duì)這些轉(zhuǎn)化事件的分析的準(zhǔn)確性以及轉(zhuǎn)化材料的遺傳穩(wěn)定性均會(huì)產(chǎn)生影響，所以需進(jìn)一步對(duì)目的基因插入的拷貝數(shù)作較精準(zhǔn)的分析。對(duì)目的基因表達(dá)量與目標(biāo)性狀間的相關(guān)性分析方法，尤其是有關(guān)轉(zhuǎn)基因植株中耐草甘膦基因的表達(dá)量與植株的草甘膦耐性性狀間的相關(guān)分析報(bào)道的還很少，如何將基因表達(dá)量與目標(biāo)性轉(zhuǎn)相互對(duì)應(yīng)作更科學(xué)合理的分析還值得深思。此處需要注意的是，雖然對(duì)照植株最后全部死亡，但在調(diào)查期間仍有受除草劑傷害的存活植株，表中所列數(shù)據(jù)為尚存活植株的數(shù)據(jù)。總之，對(duì)不同轉(zhuǎn)化事件材料應(yīng)分別對(duì)待，并非轉(zhuǎn)化成功的事件就一定是實(shí)用的轉(zhuǎn)化事件；雖然T2代后，各轉(zhuǎn)化事件的后代株系的陽(yáng)性結(jié)果率、除草劑耐性、目的基因表達(dá)量等雖存在一定差異，但總趨勢(shì)是一致的，不影響對(duì)結(jié)果的分析。

花粉介導(dǎo)法［23］、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與基因槍轟擊法結(jié)合［33］等在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的作用，在我國(guó)已有一定的研究基礎(chǔ)，前者操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化率高，具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，缺點(diǎn)重復(fù)性差，后者是以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)，外源基因在植物細(xì)胞中的拷貝數(shù)較低，遺傳穩(wěn)定性好，同時(shí)該方法吸收了基因槍轟擊法受體類(lèi)型廣泛、可控性好等優(yōu)點(diǎn)。在具有廣闊領(lǐng)域和美好前景的植物基因工程研究中，探討簡(jiǎn)潔、快速、高效的轉(zhuǎn)化方法仍是決定植物基因工程研究進(jìn)展快慢的關(guān)鍵所在。

本研究中所調(diào)查的轉(zhuǎn)基因株系（植株）草甘膦耐性是在噴霧除草劑條件下進(jìn)行的，今后的研究中應(yīng)將除草劑濃度設(shè)計(jì)成一個(gè)梯度，對(duì)同一株系材料分別噴霧不同濃度的除草劑，得出轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)草甘膦除草劑的最高耐受值或各株系轉(zhuǎn)基因材料的除草劑耐受范圍；同時(shí)對(duì)研究過(guò)程中的基因丟失現(xiàn)象、目的基因表達(dá)量的高低都應(yīng)做進(jìn)一步分析，以確保目的基因在轉(zhuǎn)化材料中的遺傳穩(wěn)定性并減少因重復(fù)篩選而增大的工作量；另外對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物中目的基因的安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)、轉(zhuǎn)基因?qū)D(zhuǎn)化個(gè)體或群體農(nóng)藝性狀的影響等需做更深入的探討，為轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化提供安全、可靠的育種資源。

4 結(jié)論

利用花粉介導(dǎo)法將耐草甘膦基因aroA-M12導(dǎo)入玉米，可以獲得轉(zhuǎn)基因植株，并且提高了轉(zhuǎn)化植株的除草劑耐性；轉(zhuǎn)化植株后代可以耐受0.25%-0.5%濃度的草甘膦除草劑，目的基因表達(dá)量達(dá)到70 ng/g葉片鮮重時(shí)，噴施除草劑的植株不受損傷，除草劑耐性性狀與目的基因表達(dá)量間的相關(guān)性達(dá)極顯著水平，相關(guān)系數(shù)為r=0.942 3（P＜0.01）。通過(guò)篩選最終獲得T2-8、T2-23、T2-37和T2-49四個(gè)轉(zhuǎn)基因純合株系。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Development of Transgenic Maize Plants Tolerant to Glyphosate via Pollen-mediated Transformation and Their Glyphosate Tolerance

YANG Hui-zhen1，2REN Zhi-qiang2XIAO Jian-hong2BU Hua-hu2LIU Hui-min2
（1. Crop Science Institute，Shanxi Academy of Agricultural Science，Taiyuan 030031；2. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on the Loess Plateau of Ministry of Agriculture，Taiyuan 030031）

In order to develop transgenic maize plants tolerant to glyphosate and further study their herbicide tolerance and the genetic characteristics of exogenous gene in transgenic plants，plasmid pBI101-aroA-M12 harboring aroA-M12 gene was transformed into maize inbred Chang ‘7-2’ plants by pollen-mediated transformation method. Fifty-four transgenic plants were obtained by PCR detection and Southern blot analysis. The detection results of molecular analysis and bioassay in the field showed that target aroA-M12 gene was integrated into the genome of transgenic plants and could stably inherit to next generation. Moreover，the aroA-M12 gene conferred the glyphosate-tolerance to transgenic plants. The result of genetic rule of target gene in transgenic plants suggested that the target gene was segregated according to the ratio of 3∶1 in T2generation transgenic plants（lines）and it was consistent with the Mendel law of single-factor heredity. The results of ELISA analysis and protein concentration determination of transgenic plants confirmed that the target gene was expressed in transgenic plants，and the protein amount of gene expression were 40.5-112.6 ng/g leaf fresh weight，there was a significant correlation between protein amount of expression of each transgenic plant and corresponding glyphosate-tolerance of that plant，correlation coefficients r = 0.942 3（P＜0.01）. Ultimately，4 pure lines of transgene with high glyphosate-tolerance were obtained from this experiment.

maize；aroA-M12 gene；glyphosate-tolerance；pollen-mediated transformation；genetic analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.018

2016-06-01

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專(zhuān)項(xiàng)（2014ZX08003001-002-003，2016ZX08003001-002-003），山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（201603D221002-3）

楊慧珍，女，學(xué)士，副研究員，研究方向 ：玉米遺傳育種 ；E-mail ：18636626922@163.com