紅麻MYB21基因的克隆、表達及載體構建

錢景華 周步進 孔祥軍 李增強 史奇奇 廖小芳 周瑞陽 陳鵬

（廣西大學農學院 廣西高校植物遺傳育種重點實驗室，南寧 530004）

紅麻MYB21基因的克隆、表達及載體構建

錢景華 周步進 孔祥軍 李增強 史奇奇 廖小芳 周瑞陽 陳鵬

（廣西大學農學院 廣西高校植物遺傳育種重點實驗室，南寧 530004）

克隆紅麻不育系和保持系的MYB21基因，分析MYB21基因在紅麻不育系和保持系各器官的表達量，并構建過表達載體和RNAi載體，旨在為進一步研究該基因在紅麻中的功能奠定基礎。以同源克隆的方法克隆MYB21基因；用實時熒光定量的方法分析MYB21基因在紅麻不育系和保持系不同組織器官的表達模式；根據酶切-連接的方法，構建過表達載體和RNAi載體。結果顯示，紅麻MYB21基因在不育系和保持中的基因序列沒有差異，其cDNA全長序列為922 bp，包含843 bp的開放閱讀框，DNA全長序列為1 108 bp，包含3個外顯子和2個內含子（NCBI序列登錄號為KT898146）；MYB21基因主要在花藥中表達，在不育系和保持系花藥之間表達量呈極顯著差異；成功構建MYB21過表達載體和RNAi載體。成功克隆MYB21基因的全長序列；實時熒光定量結果表明MYB21基因主要在花藥中進行表達；構建的植物過表達載體PBI121-MYB21和RNAi載體pART27-PK-R1-F2可用于該基因的功能研究。

紅麻；細胞質雄性不育；MYB21基因；實時熒光定量；載體構建

紅麻（Hibiscus cannabinus L.）屬于錦葵科木槿屬一年生韌皮纖維作物，傳統用途是作為紡織、生產麻繩、麻袋、地毯等的原料。同時，紅麻也是一種多用途作物，被廣泛應用于造紙、建材、土壤修復、飼料等各種領域［1-2］。

作物細胞質雄性不育（CMS）是作物雜種優勢利用的主要途徑，利用CMS配制雜交種，克服了人工授粉的種種弊端，大大減少勞動量，同時能夠提高雜交種子的純度，增加作物的產量［3］。作物雄性不育表現為花藥（包括花粉）的發育異常。花藥的發育是一個受到嚴格調控的過程，特別是在轉錄水平的調控尤其重要。轉錄因子是這一調控過程中的主要參與者，在眾多的轉錄因子中，MYB類轉錄因子是植物中最大的一類轉錄因子家族之一。目前眾多研究結果表明MYB類轉錄因子的功能具有多樣性，包括參與植物次生代謝調控，激素和環境因子的應答，細胞分化及細胞周期等多種過程［4］。MYB21屬于R2R3型MYB類轉錄因子，Song等［5］在擬南芥中發現AtMYB21基因與AtMYB24能夠與JAZ蛋白相互作用而影響茉莉酮酸酯（JA）的代謝，從而調控雄蕊花藥的發育。姚潤鵬［6］從大白菜花瓣退化突變體的轉錄組分析中發現了MYB21基因是與花器官發育相關的。Cheng等［7］在研究赤霉素（GA）和茉莉酸（JA）對擬南芥的作用時發現GA能夠促進JA的生物合成而調控MYB21基因的表達，從而促進雄蕊花絲的延伸。但是迄今為止還沒有看到有關MYB類轉錄因子調控作物CMS發生的研究報道。本課題組前期通過轉錄組測序發現紅麻MYB21的表達量在CMS系花藥中顯著下調，故推測MYB21參與了紅麻CMS發生的調控。基于此，本研究克隆MYB21基因，研究MYB21在紅麻不育系和保持系不同的組織器官的表達模式，并構建MYB21基因的過表達與干擾載體，旨在為研究MYB21基因在紅麻花藥發育中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

紅麻不育系P3A與保持系P3B（本課題組選育）種植于廣西大學實驗基地。

主要試劑及菌株：CTAB裂解液、DEPC， DNAaseI，反轉錄試劑盒，Fastpfu酶，DNA回收試劑盒，T4 DNA連接酶，大腸桿菌感受態細胞DH5α，LB培養基，各種相關限制性內切酶，相關載體，熒光定量試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 紅麻花藥總DNA和總RNA的提取 紅麻不育系P3A和保持系P3B，取盛花期時的花藥，置于-80℃冰箱保存，采用改良CTAB法［8，9］提取總DNA和總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度測定儀來檢測DNA和RNA的完整性。

1.2.2 反轉錄 用PrimeScript Reverse Transcriptase反轉錄試劑盒（TaKaRa，日本）進行反轉錄，并以紅麻跨內含子引物COXⅡ檢測反轉錄得到的cDNA中是否含有總DNA。

表1 引物序列

1.2.3 MYB21基因全長的克隆 根據不育系（P3A）和保持系（P3B）花藥轉錄組高通量測序結果［10］設計引物（表1）擴增紅麻MYB21基因全長。PCR擴增選用高保真酶Fastpfu DNA聚合酶，擴增程序為：95℃預變性3 min；95℃ 30 s，53℃ 40 s，72℃1 min，32 個循環；72℃延伸10 min。同時以ddH2O為模板設置陰性對照。PCR產物經DNA凝膠回收試劑盒回收并連接到pMD-19T載體上，轉化到大腸桿菌感受態DH5α中，挑取陽性克隆送至華大基因測序。

1.2.4 紅麻MYB21基因過表達載體的構建 根據已經克隆的MYB21基因開放閱讀框序列設計加入相應酶切位點的一對引物ORF-R和ORF-F（表1），以紅麻花藥反轉錄得到的cDNA為模板，采用高保真酶FastPfu DNA 聚合酶進行PCR擴增，凝膠回收PCR產物，然后連接、轉化，挑取陽性克隆測序，用限制性內切酶Xba I和Kpn I雙酶切陽性質粒并凝膠回收小片段，同時雙酶切PBI121-GFP載體并回收，最后連接、轉化，以卡那霉素篩選陽性菌落，菌液測序并提取質粒進行酶切驗證。

1.2.5 MYB21基因RNAi干擾載體的構建 根據干擾載體序列選取的原則［11］，選擇MYB21基因的cDNA的428 bp序列作為干擾片段，并根據中間載體PKNANIBAL上的插入位點，設計正向引物與反向引物（表1）進行克隆。克隆得到的正向片段命名為RNAi-Z，反向片段命名為RNAi-F。

正向片段的插入：用Xho I和Kpn I雙酶切RNAi-Z質粒和PKNANIBAL質粒，經回收，連接、轉化，以卡那霉素平板篩選陽性克隆，酶切鑒定連接正確后命名為PK-R1。

反向片段的插入：用Xba I和Cla I雙酶切PK-R1和RNAi-F，經凝膠回收、連接、轉化、質粒抽提，質粒酶切確認連接正確后命名為PK-R1-F2；

最后，將PK-R1-F2連接到植物雙元表達載體pART27上：采用Not I分別酶切PK-R1-F2和pART27，回收、連接、轉化之后，以含有壯觀霉素的平板來篩選陽性克隆，菌液測序并質粒酶切鑒定后確認RNAi干擾載體構建成功，將此載體命名為pART27-PK-R1-F2。

1.2.6 熒光定量PCR 選擇紅麻甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH為內參基因，設計MYB21基因和GAPDH基因的熒光定量的引物（表1），分別用P3A和P3B的根、葉和花藥部分的總RNA反轉錄的cDNA為模板，TransStart Tip Green qPCR SuperMix熒光定量試劑盒（北京全式金公司）進行熒光定量PCR研究MYB21基因的表達模式。反應體系為15 μL：模板為1.5 μL，樣品設3次重復，同時設置以水為模板的陰性對照。以95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，36 cycles的反應程序在熒光定量儀器（Bio-Rad，美國）上進行擴增反應。

2 結果

圖1 紅麻花藥核酸質量及反轉錄檢測結果

2.1 紅麻核酸質量及反轉錄檢測

從瓊脂糖凝膠電泳圖（圖1-A）可以看出，提取的紅麻不育系P3A和保持系P3B花藥總RNA條帶清晰，完整性較好。為檢測是否含有DNA污染，以跨內含子引物對COXⅡ-R和COXⅡ-F對反轉錄的cDNA進行PCR擴增。該引物對以總DNA為模板擴增出來的片段是2 009 bp，以cDNA為模板擴增出來的片段是518 bp，瓊脂糖凝膠電泳圖結果（圖1-C）顯示，反轉錄得到的cDNA沒有總DNA殘留。cDNA質量滿足實驗的需要。

2.2 MYB21基因全長的克隆

分別以P3A和P3B花藥的cDNA以及P3B的總DNA為模板，以MYB21-R和MYB21-F為引物，克隆MYB21基因的全長，得到的克隆片段分別命名為P3A-MYB21（RNA），P3B-MYB21（RNA）以及P3BD-MYB21（圖2）。

圖2 MYB21基因擴增

將MYB21基因的cDNA序列和DNA序列用DNAMAN軟件進行比對，發現MYB21基因在cDNA和總DNA水平其核苷酸同源性達到83.21%，其中MYB21基因在不育系P3A和保持系P3B的cDNA水平上序列是一致的，它們的全長均為922 bp，開放閱讀框為843 bp，編碼280個氨基酸，而總DNA序列則包含3個外顯子和兩個內含子，其全長為1 108 bp。ATG為起始密碼子，由下圖可知第1個外顯子為155 bp，第2個外顯子129 bp，第3個外顯子559 bp，3個編碼區序列總長為843 bp，第1個內含子89 bp，第2個內含子97 bp，兩個非編碼區總長為186 bp（圖3）。序列提交到NCBI，提交的DNA序列號為：KT898146。

利用ORF finder 尋找擴增產物的最長ORF，在NCBI進行保守結構域搜索，結果（圖4）顯示所擴增的產物序列包含兩個SANT結構域，即MYB超級家族的典型保守結構域，說明所克隆得到MYB21基因是屬于R2R3型MYB轉錄因子基因。

另外，將MYB21基因所編碼的氨基酸序列與其他物種中的氨基酸序列進行比對發現，MYB21基因與雷蒙德氏棉的MYB108-like基因以及陸地棉中的MYB5基因同源性較高，序列同源性分別達到67%和63%（圖5）。

2.3 紅麻MYB21基因載體的構建

2.3.1 表達載體的構建 將用加入酶切位點的MYB21基因引物克隆所得的基因片段與PBI121-GFP載體雙酶切之后進行連接，利用PBI121載體序列所設計的引物進行菌液測序測序結果與目的基因序列通過DNAMAN進行比對（圖6），發現測序序列包含完整目的基因序列。

同時進行酶切驗證，酶切下來的片段大小與目的片段大小一致（圖7）。證明目的基因片段成功連接到表達載體中，將構建成功的表達載體命名為PBI121-MYB21。

2.3.2 干擾載體的構建 紅麻MYB21基因擴增片段大小與所選取的干擾片段大小一致，均在400 bp左右（圖8-A），雙酶切RNAi-Z和RNAi-F得到的片段長度（圖8-B）經菌液測序其結果與所選取的正向片段和反向片段序列一致，這充分說明了正向片段與反向片段成功連接到了pMD19-T載體上。對PK-R1和PK-R1-F2分別進行雙酶切，所獲得的酶切片段與干擾片段長度一致（圖8-C），說明干擾片段連接到中間載體PKANNIBAL成功。最后，對pART27-PKR1-F2用Not I酶切，并以pART27-PK-R1-F2質粒做對照，凝膠電泳圖結果（圖8-D）顯示酶切下來的片段與目的片段大小一致，同時利用PKANNIBAL載體序列的通用引物進行菌液測序，測序結果（圖9）顯示所插入的片段與目的片段堿基序列一致，說明干擾片段成功連接到相應載體上。

2.4 MYB21基因熒光定量分析

圖3 MYB21基因序列

本研究從紅麻不育系材料P3A和保持系材料P3B的根、葉和花藥中提取總RNA，進行反轉錄，通過熒光定量PCR反應，運用雙標準曲線法分析反應數據來研究MYB21基因在兩者之間不同組織器官的表達量情況。以管家基因GAPDH和MYB21基因的5個梯度濃度標準品、陰性對照和待測樣本分別設置3個重復同時上機，獲得GAPDH和MYB21基因的擴增曲線和標準曲線。結果顯示陰性對照沒有檢測到熒光信號，融解曲線峰形單一，管家基因和MYB21基因的標準曲線相關系數的R2＞0.999，表明熒光定量反應體系沒有污染，引物特異性好，且重復性較高，由此得出的熒光定量的實驗數據具有可靠性與真實性。

圖4 MYB21基因保守結構域搜索結果

圖5 MYB21基因與其它物種氨基酸序列比對

定量分析結果（圖10-A）表明MYB21基因在不育系花藥中的表達量極顯著低于保持系，僅為保持系的0.07倍，在根中表達量下調為0.28倍，而在葉片中的表達量略微高于保持系（1.41倍）。比較分析保持系的根、葉和花藥中的定量數據，發現MYB21基因主要在花藥中表達（圖10-B）。

3 討論

圖6 測序結果比對（P-1為表達載體菌液測序編號）

MYB類轉錄因子是植物中最為重要的一類轉錄因子，在植物生長發育中扮演著重要作用。Shin等［12］研究發現擬南芥中MYB21基因特異性在花中進行表達，Li等［13］利用RT-PCR技術分析了AtMYB57、AtMYB21、AtMYB24、AtMYB116和AtMYB62在擬南芥根、蓮座葉、莖生葉、花和角果中的表達量，其中MYB21基因在擬南芥各個部分都有一定量的表達，但主要是在花中進行表達。Yang等［14］研究發現與AtMYB21氨基酸序列同源性達68.5%的AtMYB24也是主要在花中表達。本研究首次從紅麻中克隆到轉錄因子MYB21，并明確了其序列結構，進一步分析了其表達模式，與前人研究結果相似，發現該基因主要在紅麻花藥中表達，在根和葉中只有輕微的表達。而且在不育系花藥中呈現極顯著下調表達模式，因此推測該基因可能參與了紅麻花藥發育的調控。

圖7 表達載體酶切驗證結果

圖8 干擾載體構建圖

Song等［5］研究了MYB21基因在轉基因擬南芥中表達量情況，當轉基因植株MYB21的表達水平是野生型擬南芥中的20-100倍時，植株出現嚴重或完全丟失育性，而表達量是野生型1-5倍時，轉基因植株其育性改變不明顯，這說明了MYB21基因的表達量水平的高低對于雄蕊發育是很重要的。因此后續研究可以將構建的過表達載體和干擾載體進行轉基因實驗，在鑒定載體構建成功的同時，一方面，將構建的過表達載體通過花粉管通道注射紅麻或葉盤法轉煙草研究MYB21基因與植物育性的關系，而且構建的過表達載體以本實驗室改造過的含有綠色熒光蛋白的PBI121為載體，為后續轉基因驗證該基因的功能及亞細胞定位提供便利。另一方面，結合RNAi載體所具有的特異性沉默某個基因表達的特性，將構建的干擾載體進行同樣的轉基因實驗，從反向遺傳學角度出發充分研究MYB21基因的功能。

圖9 干擾載體測序結果比對（PPZF6為干擾載體菌液測序編號）

圖10 MYB21基因在紅麻P3A和P3B花藥、葉片及根中的表達量

另外，轉錄因子是通過結合到靶基因而發揮作用的，Shin等［12］發現擬南芥MYB21可以直接調節苯丙氨酸裂解酶PAL和交替氧化酶AOX1a的表達，從而發揮調控苯丙氨酸的代謝過程。Song等［5］研究發現MYB21和MYB24與JAZ 蛋白結合影響花藥發育和花絲延長，并且推斷MYB21和MYB24是與JAZ蛋白分離之后激活下游各種不同的基因來參與這個過程的。因此后續研究擬進一步篩選MYB21靶基因并分析靶基因的表達模式，從而揭示MYB21在調控紅麻CMS發生的作用。

4 結論

成功克隆了紅麻不育系P3A和保持系P3B中的MYB21基因，明確了MYB21基因序列結構；分析了MYB21基因在不育系和保持系各組織器官的表達模式，研究發現MYB21基因主要在花藥中進行表達，并且兩系之間表達量呈極顯著差異；經過酶切和測序驗證，過表達載體和干擾載體構建成功，能夠用于后續轉基因功能研究。

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（責任編輯 李楠）

Cloning，Expression Analysis and Vector Construction of MYB21 Gene in Kenaf

QIAN Jing-hua ZHOU Bu-jin KONG Xiang-jun LI Zeng-qiang SHI Qi-qi LIAO Xiao-fang ZHOU Rui-yang CHEN Peng
（Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Plant Genetics and Breeding，College of Agriculture，Guangxi University，Nanning 530004）

This work is to clone MYB21 gene and analyze its expression levels in different organs of kenaf for both cytoplasmic male sterility（CMS）and its maintainer，to construct over-expression vector and RNAi vector，and to lay the foundation for further study on the function of MYB21 gene in kenaf. The MYB21 gene was cloned using a homology method. The expression patterns of MYB21 in different organs for CMS and its maintainer were analyzed by quantitative real-time PCR. Using enzyme digestion-ligation method，the expression vector and RNAi vector were constructed. As results，there was no difference on gene sequence between CMS and its maintainer. The full cDNA sequence of MYB21 gene was 922 bp，including an 843 bp open reading frame. The full DNA sequence of MYB21 gene was 1 108 bp，containing 3 exons and 2 introns（the NCBI GenBank accession number：KT898146）. MYB21 gene was predominantly expressed in anther，the expression level of MYB21 gene in anther between CMS and its maintainer was highly significant difference. Also the over-expression vector and RNAi vector were constructed successfully. In conclusion，the full-length sequence of MYB21 gene in kenaf is obtained，MYB21 gene is mainly expressed in anther of kenaf，and the over-expression vector PBI121-MYB21 and RNAi vector pART27-PK-R1-F2 can be used for function study of MYB21 gene.

kenaf；cytoplasmic male sterility；MYB21 gene；quantitative real-time PCR；vector construction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.020

2016-03-24

國家自然科學基金項目（31260341，31560421），廣西自然科學基金項目（2015GXNSFAA139059）

錢景華，女，碩士研究生，研究方向：作物雄性不育的分子機理；E-mail：15225215301@163.com

陳鵬，男，教授，博士生導師，研究方向：作物雄性不育的分子機理；E-mail：hustwell@gmail.com