馬尾松毛蟲質型多角體病毒NSP1蛋白在昆蟲細胞表達及定位

靳亮許翠萍王金昌關麗梅張穩超黃朝高學梅王洪秀

（1. 江西省科學院微生物研究所，南昌 330029；2. 江西省科學院鄱陽湖重點實驗室，南昌330029；3. 魯東大學生命科學學院，煙臺 264025；4. 江西省農業科學院農業應用微生物研究所，南昌 330200）

馬尾松毛蟲質型多角體病毒NSP1蛋白在昆蟲細胞表達及定位

靳亮1，2許翠萍3王金昌1關麗梅1張穩超1黃朝1高學梅1王洪秀4

（1. 江西省科學院微生物研究所，南昌 330029；2. 江西省科學院鄱陽湖重點實驗室，南昌330029；3. 魯東大學生命科學學院，煙臺 264025；4. 江西省農業科學院農業應用微生物研究所，南昌 330200）

馬尾松毛蟲質型多角體病毒（Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus，DpCPV）基因組S5片段編碼一個由881個氨基酸組成、分子量為101 kD的非結構蛋白（NSP1）。為探尋DpCPV NSP1蛋白的功能，將DpCPV 1基因組S5-1片段的抗原區（1-600 bp）進行了原核表達，并將純化蛋白免疫家兔，制備多克隆抗體。將稀釋后的病毒液感染甜菜夜蛾幼蟲，感染后每天解剖甜菜夜蛾并取中腸樣品，通過Western blot檢測NSP1蛋白的合成時間曲線。Western blot檢測結果顯示，S5片段表達的蛋白在病毒感染第1天就有合成，并且除了檢測到全長的蛋白（101 kD）外，也檢測到了80 kD和20 kD的蛋白條帶，說明NSP1蛋白為早期表達蛋白，并且蛋白發生了切割。另外，首次對DpCPV 1 S5片段進行了在昆蟲細胞中表達和昆蟲亞細胞定位，結果顯示，昆蟲細胞定位于細胞的細胞質。

馬尾松毛蟲質型多角體病毒；NSP1；抗體制備；真核表達；細胞定位

質型多角體病毒（Cytoplasmic polyhedrosis virus）屬于呼腸孤病毒科質型多角體病毒屬。根據第九次國際病毒分類會議制定質型多角體病毒的分類［1］，馬尾松毛蟲質型多角體病毒（Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus，DpCPV）歸為CPV-Ⅰ型，基因組由10條分段的dsRNA組成。松毛蟲是我國森林蟲害的主要害蟲，DpCPV為我國重大森林害蟲——松毛蟲的致病原，對松毛蟲具有良好的控制效果，在我國已經登記為商品殺蟲劑［2］。DpCPV主要感染昆蟲中腸上皮細胞，感染周期較長，但宿主范圍一般較寬，可以使10科36種鱗翅目昆蟲感染發病［3］。采用冰凍電鏡和計算機三維重構技術研究表明，CPV的蛋白質外殼為單層衣殼，主要有3段序列編碼的結構蛋白組成，分別是由S1片段編碼的衣殼蛋白CSP（Capsid shell protein）、S4片段編碼的塔式突起蛋白TP（Turret protein）及S7片段編碼的大突起蛋白LPP（Large protrusion protein）［4］。Cheng等［5］通過低溫電子顯微鏡研究發現，CPV的五聚體塔狀蛋白TP的酶區域是拓撲結構高度保守并且有5個連接著鳥苷酰基轉移酶和甲基轉移酶區域的獨特的通道；通過氨基酸序列推理發現，CPV的大突起蛋白LPP是由S7片段編碼P50蛋白修飾后得到的。Yang等［6］研究發現，當CPV病毒粒子進行轉錄時，衣殼蛋白VP1A、VP1B和塔狀蛋白VP3構象發生變化，衣殼空間擴大和塔狀蛋白周圍通道的加寬，使得基因組RNA從緊湊的病毒粒子衣殼更加靈活的轉錄和輸出。Yang等［7］最新研究發現，通過對Helicoverpa armigera cypovirus-5（HaCPV-5）結構蛋白VP5具有RNA分子伴侶活性，能夠促進RNA解旋并加速鏈的退火，并且促進逆轉錄酶的起始轉錄。

相對于CPV的結構蛋白的深入研究，CPV非結構蛋白的研究相對較慢。文力［8］、張萬菊［9］等對DpCPV 1基因組中的第九片段（S9）的編碼序列進行了cDNA克隆和序列測定，并對NS5蛋白的表達和功能進行了初步分析。Chen等［10］研究發現由DpCPV基因組第9片段編碼的非結構蛋白NS5蛋白在感染昆蟲細胞時，定位在昆蟲細胞的細胞膜上。段兵［11］和胡建芳等［12］對馬尾松毛蟲CPV基因組第8片段進行序列分析和原核表達。凝膠遷移阻抑分析（EMSA）顯示，由CPV基因組第8片段編碼的p44蛋白具有序列非特異性的ssRNA結合活性，不與dsRNA、ssDNA、dsDNA結合；進一步研究發現p44氨基酸序列116-197 aa之間的區域（富含谷氨酸區域）為單一的RNA結合區域［13］。

Hagiwara等［14］通過原核表達BmCPV S5片段發現S5片段序列與口蹄疫2A蛋白的編碼序列同源性高達93%。Cheng等［15］通過酵母雙雜交的方法研究發現，DpCPV S5片段編碼的NS 1蛋白能夠與多角體蛋白（Polyhedrin）發生相互作用。

目前還未有對NSP1蛋白在中腸細胞的合成過程、真核表達和細胞定位的研究。本研究通過構建DpCPV 1基因組S5片段的原核表達體系，表達純化蛋白后免疫家兔制備多克隆抗體。將稀釋后的病毒液感染甜菜夜蛾幼蟲，分時段提取中腸細胞樣品，進行Western blot檢測，判斷該蛋白合成過程。通過構建bac-to-bac系統，將DpCPV 1非結構蛋白NSP1-GFP的融合表達，判斷該蛋白在昆蟲細胞Sf9上的定位，以期為理解該蛋白在病毒復制轉錄過程中的作用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 昆蟲，質粒及菌種 甜菜夜蛾卵由中國科學院武漢病毒所昆蟲病毒基因工程學科組提供，于27℃培養。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21和DH10B菌株均為本實驗室保存；載體pMD18-T vector系統、T4 DNA Ligase及其buffer購自寶生物工程（大連）有限公司，載體pET-28a、DpCPV 1基因序列S5片段為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 M-MLV逆轉錄酶、RNA 酶抑制劑購自Promega公司；rTaq DNA聚合酶、限制性內切酶以及Buffer購自寶生物工程（大連）有限公司；DM2000 DNA Marker 購自康為世紀生物科技有限公司；預染蛋白Marker購自南京生興生物技術公司；異丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）購自武漢貝特生物公司；Ni-NTA His.BindTMResins購自Novagen公司；轉染試劑lipofectin 購自Invitrogen公司（美國）；熒光染料 Hoechst 33258 購自BIOSHARP公司（美國）；PVDF膜購自Millipore公司（美國）；PCR純化試劑盒購自PROMEGA公司（上海）；質粒提取試劑盒購自PROMEGA公司（上海）；其余藥品均為國產分析純。

1.1.3 引物合成 根據DpCPV 1基因組S5-1片段的核苷酸序列的抗原區（核酸序列1-600 bp），設計引物；除通用引物M13F 和M13R（Cat. No. N530-02，Invitrogen公司，美國）外，其余引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物列表詳見表1。

表1 PCR擴增產物所需引物列表

1.2 方法

1.2.1 DpCPV 1 S5-1 ORF全長的原核表達 DpCPV基因組通過SDS熱酚法進行抽提［16］。以DpCPV病毒基因組中回收得到的S5-1片段為模板，以S5-1為引物，利用兩步法進行RT-PCR擴增［17］。PCR擴增的片段通過相應的酶切位點酶切，連接到原核表達載體pET28a（pET28a-S5-1）。將陽性重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞BL21，1 mmol/L的IPTG于37℃誘導表達4 h。收集菌體，經超聲破碎后離心，獲得包涵體蛋白。經8 mol/L的尿素溶液溶解包涵體蛋白，然后通過Ni-NTA樹脂柱進行蛋白純化并為下一步制備抗體做準備。

1.2.2 抗體制備 純化的目的蛋白用常規方法（淋巴加皮下注射）免疫家兔，制備抗血清。實驗兔飼養，抗原注射及最終采血均委托武漢愛博泰克生物科技有限公司進行。

1.2.3 DpCPV感染甜菜夜蛾幼蟲 肖宇宙等［17］通過將DpCPV病毒液感染甜菜夜蛾幼蟲后，出現典型的CPV感染癥狀，成功獲得DpCPV多角體病毒，證明甜菜夜蛾幼蟲也是DpCPV 的易感宿主。將病毒原液稀釋成5×104PIB/mL，將飼料塊分成1 mm的正方形，每個小飼料塊上滴10 μL的病毒稀釋液。取100頭2-3齡甜菜夜蛾幼蟲，放到六孔板中，每個孔中一頭幼蟲和一塊飼料，放入27℃恒溫箱培養，每隔24 h取9頭活蟲，每3頭為一組，取中腸放入1.5 mL的離心管中，連取5 d。

1.2.4 甜菜夜蛾幼蟲中腸樣品SDS-PAGE電泳檢測 分別配制12% Tris-甘氨酸SDS-PAGE電泳分離膠和5%的Tris-甘氨酸SDS-PAGE電泳積層膠，插入1.0 mm的梳子。然后進行樣品處理，上述1-5 d的中腸樣品分別取出20 μL，加入上樣Buffer攪勻，沸水浴5 min，冰浴3 min，離心將雜質沉淀。將處理好的樣品每膠孔上樣15 μL，Protein Marker加10 μL，外加電壓80 V約1 h后待樣品液面相平時加壓至120 V。樣品跑到膠板底部即可停止。考馬斯亮藍染色過夜，脫色液脫色5 h。

1.2.5 間接酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測抗血清的效價 抗原為各基因片段純化后的原核表達產物或經蔗糖密度梯度離心純化得到的病毒粒子。先用包被液稀釋抗原，加入酶標板中，4℃包被過夜。第2天用含0.05% Tween-20的PBS（pH7.4）洗滌液清洗3次，甩干。用0.5%封閉液（PBS + 0.5% BSA + 0.05% Tween-20，pH7.4）37℃封閉30 min，然后用洗滌液清洗3次。一抗血清用洗滌液稀釋1 000倍后，再依次2倍稀釋，加入酶標板中。37℃孵育30 min，用洗滌液清洗3次，甩干。二抗（HRP標記的羊抗兔二抗）按試劑盒說明，稀釋5 000倍后，加入酶標板中，37℃孵育30 min，用洗滌液清洗3次。顯色步驟按照試劑盒說明，加入相應底物，37℃避光10 min左右顯色完成后，加入終止液終止反應。最后在酶標儀上讀取450 nm波長時的吸光值。

1.2.6 抗血清的Western blot檢測 誘導表達和純化的各蛋白及昆蟲中腸細胞經SDS-PAGE電泳后，電轉移到PVDF膜上，封閉液（TBS + 5%脫脂奶粉）4℃封閉過夜。TBS-T緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl，200 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20，pH7.5）室溫洗膜5 min。抗血清用0.5%封閉液（TBS + 0.5%脫脂奶粉）稀釋1 000倍，將膜分浸入抗血清稀釋液中，37℃溫浴1 h。TBS-T緩沖液洗膜3次，每次10 min。二抗分別為堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG，用0.5%封閉液稀釋3 000倍。將膜浸入二抗稀釋液中，37℃溫浴1 h。TBS-T緩沖液洗膜4次，每次10 min。顯色操作參照說明書進行。

1.2.7 NSP1的亞細胞定位 馬永平等［18］研究了文山松毛蟲質型多角體病毒（DpCPV2W）在昆蟲細胞中的離體增殖行為，并進行了空斑試驗，結果顯示DpCPV2W 毒株在Sf9和Sf21 細胞中均能增殖，并能產生形態正常的病毒多角體。用P2病毒貯液感染貼壁生長24 h的Sf9細胞（覆蓋玻底培養皿50%），27℃培養24 h，移除細胞培養基，用PBS（pH7.4）將細胞洗1遍，加入4%多聚甲醛（過濾除菌）室溫靜置固定15 min，再用PBS（pH7.4）將細胞洗1遍；加入透化液（0.25% triton×100），室溫靜置10 min；用PBS（pH7.4）洗滌細胞，加熒光染料hoechst

33258染核5-10 min，然后用PBS洗3遍，再加入1 mL PBS。激光共聚焦顯微鏡（TCS SP2，Leica，德國）觀察綠色熒光分布情況。

1.2.8 序列統計分析與系統發育樹構建 將DpCPV 1基因組S5片段，放入NCBI上進行Blast序列比對（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。利用Mega4.0分析軟件進行聚類分析，并采用軟件 ClustalW和PHYLIP3.67的鄰近法構建系統發育樹。

2 結果

2.1 DpCPV 1基因組S5片段和其編碼非結構蛋白

NSP1的系統發育分析

通過系統發育樹分析，DpCPV 1 基因組S5片段與舞毒蛾質型多角體病毒（LdCPV 1）基因組S5片段（AF 389466.1）和DpCPV（武大株）的S5片段（AY 185594.1）具有最高的序列同源性（99%），分別與5株家蠶質型多角體病毒（BmCPV 1）Strain H、Strain I、Strain suzhou、BmCPV S5（KR704200.1）和BmCPV S5（AF433660.1）對應片段的同源性為80%、80%、80%、80%和79%（圖 1）。DpCPV 1 S5片段編碼非結構蛋白NSP1的系統發育樹分析顯示：NSP1蛋白與DpCPV（武大株）和LdCPV 1的同源性為99%，與BmCPV 1 p101（GI：16660648）同源性88%，與另外4種BmCPV同源性為87%，與冬尺蠖蛾質型多角體病毒（Operophtera brumata cypovirus 18）的相應非結構蛋白氨基酸序列同源性為61%（圖2）。另外，我們檢測到了NSP1蛋白與手足口病毒（Foot-and-mouth disease virus-type O） 的VP1蛋白的部分序列有89%的氨基酸序列同源性。

圖1 DpCPV1基因組S5片段的核酸系統發育樹

2.2 DpCPV S5片段的分子克隆和抗體制備

以S5-1為正反向引物，以DpCPV 1基因組S5截短片段（S5-1）為模板進行RT-PCR擴增，擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段大小600 bp。將S5-1連接至pET28a載體上，構建表達質粒。用BamHⅠ和Hind III雙酶切驗證正確后，命名為pET28a-S5-1。經測序，將鑒定正確的克隆質粒pET28a-S5-1轉化大腸桿菌BL21，加IPTG誘導后離心收集菌體，進行SDS-PAGE分析。如圖3所示，檢測到插入的S5-1片段的載體有相應蛋白的表達，蛋白大小約為30 kD。因插入的S5-1片段后面攜帶了一個His純化標簽（大小約7 kD），所以實際插入S5-1片段表達的蛋白大小為23 kD，與S5-1片段表達蛋白大小相符。通過His純化標簽經Ni-NTA純化樹脂純化包涵體的目的蛋白后，所得純化蛋白免疫家兔，制備NSP1蛋白的多克隆抗體anti-S5-1。

圖2 DPCPV 1 NS1蛋白的系統發育樹

2.3 昆蟲中腸細胞中S5編碼蛋白的Western blot檢測

采用間接ELISA方法檢測S5-1抗體的效價，在450 nm波長下讀取吸光度值。結果顯示，以原核表達產物為抗原，抗體效價在1∶3 000左右；以經過蔗糖密度梯度離心純化得到的病毒粒子為抗原，抗體效價在1∶200左右。因此對S5-1抗體稀釋1 000倍后用于檢測。將感染病毒的中腸細胞離心取上清經SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉膜后經過Western blot檢測DpCPV 1 S5片段編碼蛋白NSP1在昆蟲中腸細胞內的表達情況。如圖4-B顯示，病毒感染的昆蟲中腸細胞（第1-5泳道）在100、80和23 kD處有明顯條帶，條帶是S5片段編碼蛋白的真核表達蛋白。結果顯示，在感染病毒的第1天S5片段編碼的蛋白即已表達，屬于早期表達蛋白，而且發生了切割。

2.4 非結構蛋白NSP1蛋白的亞細胞定位

用P3代病毒感染昆蟲細胞Sf9后24 h，用激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白的亞細胞定位情況。結果表明，昆蟲細胞Sf9被桿狀病毒感染后，細胞核明顯增大，經熒光染料 Hoechst 33258染洗后，紫色部位為細胞核。而融合了NSP1的eGFP的蛋白則主要聚集在細胞質中（圖5-A），而沒有融合NSP1的EGFP均勻地分布于整個細胞中（圖5-C），說明S5片段編碼的非結構蛋白NSP1主要定位細胞質中。

圖3 DpCPV 1的S5-1的PCR和原核表達純化SDSPAGE圖

圖4 昆蟲中腸細胞中S5編碼蛋白的動態曲線圖譜

圖5 融合了EGFP的NSP1在昆蟲細胞中的定位

3 討論

本研究通過克隆 DpCPV 1基因組S5-1片段插入到原核表達載體BL21內，原核表達NSP1蛋白的抗原區部分。經SDS-PAGE電泳檢測到誘導表達的蛋白大小約32 kD，這是因為在構建表達S5-1片段的后面添加了一個His純化標簽，純化標簽的蛋白大小約7 kD。所以DpCPV 1基因組S5-1片段原核表達蛋白的大小約25 kD，與NSP1的蛋白大小相符。將DpCPV 1 S5-1片段原核表達蛋白免疫家兔，制備了NSP1的多克隆抗體。

將DpCPV1感染甜菜夜蛾幼蟲，取中腸樣品進行Western blot檢測，Western blot檢測結果顯示，DpCPV 1 S5片段編碼的非結構蛋白從第1天就出現，并發現產生了切割修飾為早期表達蛋白，表達的蛋白大小分別為101、80 和21 kD，隨時間增加并未遞減。這種蛋白切割現象此前也在DpCPV 1的其它片段表達的蛋白中發現過。如Jin等［18］將DpCPV 1感染甜菜夜蛾幼蟲，取中腸樣品經Western blot檢測發現，DpCPV 1 S7片段編碼的蛋白p50在感染的第3天表達的蛋白大小為50 kD，在感染的第5天發現該蛋白發生切割修飾，修飾后的蛋白大小為31 kD，上述數據證實了DpCPV S7片段在真核細胞內表達的蛋白發生了切割。因此，我們推測NSP1蛋白在真核細胞內發生了降解或者被昆蟲細胞的某些酶切割或修飾。用激光共聚焦顯微鏡觀察Bac-S5-eGFP的融合蛋白的亞細胞定位發現，融合NSP1的綠色熒光蛋白（eGFP）主要聚集在細胞質中，沒有融合eGFP的分布于整個細胞，說明 DpCPV 1的非結構蛋白NSP1定位于細胞質中。

4 結論

對馬尾松毛蟲質型多角體病毒基因組S5片段編碼NSP1蛋白的表達時相進行檢測發現，該蛋白為早期表達蛋白，且在合成過程中發生了切割；對NSP1蛋白進行昆蟲細胞定位，結果顯示該蛋白定位于Sf9細胞的細胞質。

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（責任編輯 狄艷紅）

Expression and Cellular Localization of Dendrolimus puntatus Cytoplasmic Polyhedrosis Virus NSP1 in Insects

JIN Liang1，2XU Cui-ping3WANG Jin-chang1GUAN Li-mei1ZHANG Wen-chao1HUANG Chao1GAO Xue-mei1WANG Hong-xiu4
（1. Institute of Microbiology，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330029；2. Key laboratory of Poyang Lake，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330029；3. College of Life Science，Ludong University，Yantai 264025；4. Institute of Agricultural Applied Microbiology，Jiangxi Agricultural Academy of Sciences，Nanchang 330200）

Genome segment 5 of Dendrolimus puntatus cytoplasmic polyhedrosis virus（DpCPV）was predicted to encode a protein of 881 amino acids with a molecular mass of 101 kD non-structural protein（NSP1）. In order to study the function of the DpCPV NSP1 protein，PCR primers were designed according to the S8 segment genome sequence. The antigen of DpCPV 1 genome S5-1 piece’s area（1-600 bp）was in prokaryotic expression，and the polyclonal antibodies against the expressed proteins were raised in rabbits. The diluted virus was used to infect Autographa californica，midgut anatomical samples were taken in each day after infection，and the synthesis curve of NSP1 protein vs time was measured by Western blot. The results of Western blot indicated that the synthesized protein expressed by S5 segment was observed in the first day of infection；in addition to full length protein（101 kD），20 kD and 80 kD protein bands also were detected，indicating that the expression of NSP1 was initiated in early stage and cleaving of NSP1 protein occurred. Moreover，for the first time，the DpCPV 1 S5 fragment was expressed in insect cells and subcellular localization of insects was observed. The results revealed that the NSP1 protein was present in the cytoplasm of the cells.

Dendrolimus puntatus cytoplasmic polyhedrosis virus；NSP1；polyclonal antibody preparation；eukaryotic expression；cellular localization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.024

2016-04-01

國家自然科學基金項目（31260031），江西省科技重大專項基金項目（2014ACF60002），中國科學院開放基金項目（2014AEM003），江西省科學院鄱陽湖中心重點實驗室項目（[2013]19號-07）

靳亮，男，博士，研究方向：昆蟲病毒分子生物學研究及生物農藥產業推廣 ；E-mail: jinliang079@163.com