人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向支架修復(fù)山羊膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

張雨，劉舒云，郭維民，郝春香，王明杰，苑志國(guó)，黃靖香，眭翔，張莉，盧世璧，郭全義

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人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向支架修復(fù)山羊膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

張雨，劉舒云，郭維民，郝春香，王明杰，苑志國(guó)，黃靖香，眭翔，張莉，盧世璧，郭全義

目的 探索人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向支架構(gòu)建組織工程軟骨，用于修復(fù)山羊膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)全層軟骨缺損的可行性。方法 從人臍帶中分離、擴(kuò)增培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定；以豬源脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向支架為組織工程軟骨支架載體；在成年山羊膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)股骨髁處造全層軟骨模型；實(shí)驗(yàn)分為兩組，以人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向支架修復(fù)組為實(shí)驗(yàn)組，單純?nèi)珜榆浌侨睋p造模作為對(duì)照組，每組 3 只山羊。術(shù)后7 d、14 d 分別抽取關(guān)節(jié)液涂片行 H&E 染色，觀察炎癥反應(yīng)。在術(shù)后 3、6 個(gè)月后分別處死兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取材進(jìn)行大體形態(tài)學(xué)觀察及評(píng)分、組織學(xué)染色及評(píng)分、軟骨特異性基質(zhì)成分定量檢測(cè)。結(jié)果 ①關(guān)節(jié)液涂片 H&E 染色結(jié)果顯示，術(shù)后兩組膝關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)未見明顯差異。②大體形態(tài)學(xué)觀察及組織學(xué)染色結(jié)果均證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組修復(fù)區(qū)再生的關(guān)節(jié)軟骨更加接近天然軟骨，且與周邊整合良好，獲得更好的修復(fù)效果。大體形態(tài)學(xué)及組織學(xué)評(píng)分均證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組的評(píng)分均要明顯高于對(duì)照組（< 0.05）；③糖胺多糖定量檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組（< 0.05）。結(jié)論 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向支架構(gòu)建組織工程軟骨，可用于修復(fù)山羊膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)全層軟骨缺損，是未來治療軟骨損傷較有應(yīng)用前景的方法之一。

充質(zhì)干細(xì)胞； 細(xì)胞外基質(zhì)； 組織支架； 組織工程； 軟骨，關(guān)節(jié)

關(guān)節(jié)軟骨在關(guān)節(jié)中發(fā)揮著重要的功能，如潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、緩沖振蕩及傳遞負(fù)荷等[1]。由于軟骨組織缺乏血管、神經(jīng)的特殊性，導(dǎo)致其一旦損傷將不能自愈。往往伴隨著膝關(guān)節(jié)的腫脹、疼痛、功能障礙，極大地影響患者的身心健康和社會(huì)功能[2-3]，遠(yuǎn)期不可避免地發(fā)生骨性關(guān)節(jié)炎。組織工程理念的提出給組織再生與修復(fù)帶來了新的希望，并展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛能。特別是軟骨組織工程方面，有望成為軟骨修復(fù)與再生最具有希望的策略之一。種子細(xì)胞和支架材料是軟骨組織工程中最為重要的部分，尋找一種便于臨床轉(zhuǎn)化的優(yōu)良軟骨組織工程種子細(xì)胞，并復(fù)合適合種子細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的支架材料，用于構(gòu)建組織工程軟骨更是當(dāng)前軟骨組織工程研究的熱點(diǎn)之一。

軟骨組織工程最理想的種子細(xì)胞自然是來源于自體的軟骨細(xì)胞[4]，但是由于其來源受限且體外擴(kuò)增易發(fā)生去分化，給患者帶來二次的軟骨損傷等缺點(diǎn)，于是尋找一種便于臨床轉(zhuǎn)化的優(yōu)良軟骨組織工程種子細(xì)胞顯得尤其重要。近年來，來源于圍產(chǎn)期組織的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因其具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)而受到廣泛的關(guān)注。前期的基礎(chǔ)研究證實(shí)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不但具有和成體間充質(zhì)干細(xì)胞相似的多系分化潛能，還具有更好的細(xì)胞活性、增殖能力和極低的免疫原性等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。另外，由于其在孕婦生產(chǎn)后視為遺棄物，所以其來源更為廣泛，不會(huì)對(duì)患者造成二次損傷，無倫理爭(zhēng)議，更加利于臨床的轉(zhuǎn)化和應(yīng)用。我們實(shí)驗(yàn)室前期制備了豬源脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向支架，該支架一方面來源于軟骨組織，可以為種子細(xì)胞提供更加優(yōu)良的生長(zhǎng)、分化微環(huán)境；另一方面仿生天然軟骨的垂直取向結(jié)構(gòu)，可以很好地引導(dǎo)種子細(xì)胞的取向性再生。前期的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)該支架具有良好的軟骨損傷修復(fù)效果。

本實(shí)驗(yàn)在前期的研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外取向支架構(gòu)建的三維組織工程軟骨，探索其在山羊體內(nèi)修復(fù)全層膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨缺損的可行性，旨在為未來的軟骨再生與修復(fù)提供一種具有希望和應(yīng)用前景的組織工程軟骨修復(fù)策略。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 于本院產(chǎn)科經(jīng)患者知情同意后獲得足月產(chǎn)健康人臍帶適量。取本實(shí)驗(yàn)室制備好的豬源脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向軟骨支架[7-8]，切為直徑與厚度分別為 6.5 mm 和1.5 mm大小，并進(jìn)行60Co 消毒備用。

1.1.2 試劑 DMEM/F12 購(gòu)自美國(guó) Corning 公司；胰蛋白酶-EDTA 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；CD45-PE 購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司；速眠新 II 購(gòu)自長(zhǎng)春市軍需大學(xué)獸醫(yī)研究所；鹽酸丁卡因購(gòu)自武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司；組織糖胺多糖比色法定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8 ~ 12 個(gè)月齡健康成年雄性普通山羊，體重 30 ~ 40 kg。大動(dòng)物手術(shù)通過解放軍總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的論證。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定獲取足月產(chǎn)產(chǎn)婦新鮮臍帶，經(jīng)無菌處理及去除血液后，置于 DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中剔除動(dòng)靜脈血管。培養(yǎng)基再次清洗數(shù)次，剪為 1 mm3大小組織塊，以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N于直徑 15 cm 的培養(yǎng)皿中，加 5.0 ml DMEM/F12（含 10% 胎牛血清）培養(yǎng)基，置于 37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。次日加入 10.0 ml 相同培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 ~ 5 d 更換培養(yǎng)基，10 ~ 14 d 后剔除組織塊。待細(xì)胞貼壁融合至 80% 時(shí)，用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化收集細(xì)胞，按 1:3 的比例傳代至第 3 代后，用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化收集細(xì)胞，每管加 100 μl 密度為 1 × 106/ml 的單細(xì)胞懸液，然后分別加入 CD29-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD14-PE、CD34-PE、CD45-PE 抗體各 10 μl，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌重懸，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，Cell-Quest（Mac）軟件分析，每個(gè)樣本至少收獲20 000 個(gè)細(xì)胞。

1.2.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向支架體外構(gòu)建組織工程軟骨修復(fù)體 取第 3 代經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定的目的人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌 3 遍，0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)。每管加 1 × 107個(gè)細(xì)胞懸液，以 1200 r/min離心 5 min，小心棄去上清液，加入 l00 μl DMEM/F12（含 10% FBS）培養(yǎng)基，再次混勻細(xì)胞呈細(xì)胞懸液，用移液槍吸取細(xì)胞懸液以滴種方法種植在已經(jīng)消毒的脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向支架上，成功構(gòu)建組織工程軟骨復(fù)合體，2 h 后加 5 ml 同樣培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 3 d 后準(zhǔn)備移植至山羊膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損處。

1.2.3 組織工程軟骨復(fù)合體修復(fù)山羊膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)全層軟骨缺損體內(nèi)試驗(yàn) 具體手術(shù)過程見圖 1，待手術(shù)的山羊在手術(shù)實(shí)施前禁食 12 h，禁水 4 h，右膝關(guān)節(jié)備皮。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在速眠新II（0.15 ml/kg）肌肉注射麻醉后聯(lián)合鹽酸丁卡因（1 mg/kg）膝關(guān)節(jié)局部浸潤(rùn)麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上將右側(cè)膝關(guān)節(jié)剪毛及消毒，鋪巾，取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口切開皮膚，沿髕旁內(nèi)側(cè)入路切開關(guān)節(jié)囊，將髕骨連同髕韌帶一起推向外側(cè)，充分暴露股骨內(nèi)、外側(cè)髁，用眼科角膜環(huán)鉆分別在股骨內(nèi)、外側(cè)髁處旋轉(zhuǎn)式切下一直徑為 6.5 mm，深度約 1.5 mm 的圓形軟骨組織，造成全層關(guān)節(jié)軟骨缺損。注意在旋轉(zhuǎn)切割時(shí)應(yīng)一邊旋轉(zhuǎn)環(huán)鉆，一邊由助手協(xié)助用無菌生理鹽水沿環(huán)鉆周邊滴注，防止旋轉(zhuǎn)產(chǎn)熱損傷周邊軟骨組織，同時(shí)注意鉆切的缺損深度，防止損傷軟骨下骨結(jié)構(gòu)。在全層軟骨缺損造模完成的基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行不同處理。實(shí)驗(yàn)組手術(shù)：取準(zhǔn)備好的無菌的復(fù)合人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程軟骨復(fù)合體放在軟骨缺損處并用生物蛋白膠粘貼固定。對(duì)照組手術(shù)：在全層軟骨缺損造模的基礎(chǔ)上不做處理。清理關(guān)節(jié)腔，髕骨復(fù)位，逐層縫合關(guān)節(jié)囊、筋膜及皮膚。術(shù)后把羊放置于溫暖環(huán)境，做好分組標(biāo)記，肌肉注射青霉素 160 萬單位/d，連續(xù) 5 d，預(yù)防感染發(fā)生。術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物圈養(yǎng)，自由活動(dòng)。

圖 1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合在脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向支架構(gòu)建的組織工程軟骨修復(fù)山羊膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損的手術(shù)過程（A：正常膝關(guān)節(jié)；B：膝關(guān)節(jié)股骨髁造直徑為 6.5 mm 的全層軟骨缺損，右上角為切下的軟骨組織；C1：空白對(duì)照組；C2：實(shí)驗(yàn)組）

Figure 1 The operation process showed hUCSCs combined with ACECM oriented scaffold was transplanted to repair articular cartilage defects in caprine model [A: Normal knee joint; B: Cartilage damaged model with 6.5 mm diameter and removed cartilage tissue (top right corner); C1: Blank control group; C2: Experimental group]

1.2.4 主要觀察指標(biāo)

1.2.4.1 炎癥反應(yīng)水平：在手術(shù)后第7和 14 天，分別在無菌操作下抽取山羊手術(shù)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液進(jìn)行外觀觀察和關(guān)節(jié)液涂片 H&E 染色，觀察關(guān)節(jié)液細(xì)胞類型和任意 3 個(gè)視野內(nèi)炎癥細(xì)胞所占的比例，分析炎癥反應(yīng)程度。

1.2.4.2 大體觀察及形態(tài)學(xué)評(píng)分 分別在術(shù)后的第3、6 個(gè)月通過安樂死的方式處死山羊，取材觀察山羊膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處的軟骨修復(fù)情況，并通過國(guó)際軟骨修復(fù)大體形態(tài)學(xué)評(píng)分進(jìn)行評(píng)分。

1.2.4.3 組織學(xué)染色 將取材的標(biāo)本用 4% 中性甲醛緩沖液固定1周，配制 100 g/L 的 EDTA 和 40 g/L 的 NaOH 混合溶液脫鈣，再經(jīng)梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片。分別作H&E、甲苯胺藍(lán)和天狼猩紅染色，檢測(cè)軟骨缺損的修復(fù)情況，并采用 MODS（Modified O’Driscoll Score）評(píng)分系統(tǒng)對(duì)修復(fù)組織進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。

1.2.4.4 糖胺多糖定量檢測(cè) 將取材新鮮的標(biāo)本用與實(shí)驗(yàn)手術(shù)所用的同一大小的角膜環(huán)鉆以損傷區(qū)為中心環(huán)形旋轉(zhuǎn)切割缺損修復(fù)區(qū)，除去軟骨下骨組織，用蒸餾水洗干凈。參照組織糖胺多糖比色法定量檢測(cè)試劑盒步驟測(cè)定每個(gè)標(biāo)本中糖胺多糖的含量，比較分析兩組間的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 19.0 軟件對(duì)各組、各時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值進(jìn)行單因素方差分析，以< 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取、培養(yǎng)及鑒定（A：人臍帶組織；B：分離、培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞光鏡下細(xì)胞形態(tài)結(jié)果）

Figure 2 The resource, culturing and identification of hUCSCs (A: Human umbilical cord; B: The result of hUCSCs in light microscope)

2 結(jié)果

2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及死活細(xì)胞染色

光鏡下人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)紡錘形，處于分裂期細(xì)胞較多，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，見圖 2。第三代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果報(bào)告顯示細(xì)胞表面抗原高表達(dá) CD44、CD73、CD90、CD105（陽(yáng)性率均≥ 95%），不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記 CD34、CD45、HLA-DR（陽(yáng)性率均 < 2%），具有干細(xì)胞生物學(xué)特性，見圖 3。第三代的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合到生物軟骨支架后第 3 天，經(jīng)死活細(xì)胞染色（FDA-PI）后激光共聚焦顯微鏡三維掃描成像觀察細(xì)胞生長(zhǎng)良好，均勻分布在三維取向軟骨支架中，很少有死細(xì)胞存在，可見支架具有很好的生物相容性，見圖 4。

圖 3 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果（CD44、CD105、CD90 及 CD73 的陽(yáng)性率均在 95% 以上）

Figure 3 The surface markers of hUCSCs (flow cytometry, CD44+, CD105+, CD90+and CD73+> 95%)

圖 4 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合在脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向支架后 3 d 的死活細(xì)胞染色（FDA/PI）共聚焦結(jié)果，紅色熒光為死細(xì)胞，綠色熒光為活細(xì)胞

Figure 4 The live/dead cells test results of hUCSCs after seeded in ACECM oriented scaffold was performed by FDA/PI after 3 d, confocal microscopy, red means dead cells, green means live cells

2.2 炎癥反應(yīng)

在術(shù)后第7 天和 14 天兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液 H&E 染色結(jié)果顯示以少量中性粒細(xì)胞為主，散在巨噬細(xì)胞分布，平均每個(gè)低倍鏡視野炎性細(xì)胞的數(shù)量沒有明顯的差異，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組沒有明顯的炎癥反應(yīng)差異，見圖 5。

空白對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 Blank control group Experimental group 7 d14 d

Figure 5 The H&E staining results of knee joint fluid after operation (× 100, optical microscope)

2.3 標(biāo)本大體觀察及大體形態(tài)學(xué)評(píng)分

所選用普通成年雄性山羊 6 只，無一只動(dòng)物術(shù)后發(fā)生感染或死亡，均在第一次手術(shù)后 3 或6 個(gè)月取材進(jìn)入結(jié)果分析。3 個(gè)月的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)組可見軟骨缺損尺寸較對(duì)照組已經(jīng)明顯減小，新生軟骨樣組織覆蓋了軟骨下骨，缺損處與正常軟骨邊緣整合良好；對(duì)照組缺損處暴露的全層軟骨缺損大小與最初造模時(shí)相近，只有缺損邊緣可見極少量纖維結(jié)締組織生成。在術(shù)后 6 個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組的軟骨缺損處幾乎完全被新生軟骨組織所填充修復(fù)，表面光滑，周邊與宿主組織整合完好；而對(duì)照組缺損還較大，新生組織較少（圖 6）。國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)-軟骨修復(fù)大體評(píng)分結(jié)果也證實(shí)實(shí)驗(yàn)組（3 個(gè)月：5.4 ± 1.2；6 個(gè)月：18.7 ± 2.2）修復(fù)效果明顯優(yōu)于對(duì)照組（3 個(gè)月：0.6 ± 0.1；6 個(gè)月：2.3 ± 1.6），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。

空白對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 Blank control group Experimental group 3 個(gè)月3 months6 個(gè)月6 months國(guó)際軟骨修復(fù)大體形態(tài)學(xué)評(píng)分ICRS score2520151050空白對(duì)照組Blank control group實(shí)驗(yàn)組Experimental group 3 個(gè)月 6 個(gè)月 A3 months 6 monthsB

Figure 6 The gross morphology (A) and ICRS score (B) of repaired knee joints in 3-month and 6-month (*significant different between two groups,< 0.05)

2.4 組織學(xué)染色及組織學(xué)評(píng)分

H&E 染色結(jié)果顯示，3 個(gè)月時(shí)，實(shí)驗(yàn)組缺損處已被新生組織部分填充并覆蓋軟骨下骨，新生組織與周邊組織過渡整合自然且緊密，空白對(duì)照組缺損處無新生組織，軟骨下骨暴露；6 個(gè)月時(shí)，實(shí)驗(yàn)組新生組織已經(jīng)填充軟骨缺損處，并與周邊組織界面齊平，可見有早期的軟骨陷窩形成，空白對(duì)照組缺損處有一薄層新生組織覆蓋于軟骨下骨表面，見圖 7A。

甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示，3 個(gè)月時(shí)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組染色均為陰性，實(shí)驗(yàn)組新生組織為不成熟軟骨組織；在 6 個(gè)月結(jié)果中，實(shí)驗(yàn)組甲苯胺藍(lán)染色較深，明顯優(yōu)于空白對(duì)照組，其新生組織表現(xiàn)為較為成熟的軟骨組織，見圖 7A。

天狼猩紅染色結(jié)果顯示，在偏光鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)組在 3 個(gè)月時(shí)修復(fù)區(qū)呈現(xiàn)為緊密排列，強(qiáng)雙折光性的黃色或紅色為主要的I型膠原纖維；6 個(gè)月時(shí)，實(shí)驗(yàn)組呈現(xiàn)為弱雙折光，多種色彩的疏松網(wǎng)狀分布為主的II型膠原纖維，空白對(duì)照組則呈現(xiàn)紅色的強(qiáng)雙折光的 I型膠原纖維為主的修復(fù)，見圖 7A。

組織學(xué)評(píng)分結(jié)果進(jìn)一步得出實(shí)驗(yàn)組（3 個(gè)月：6.3 ± 2.3；6 個(gè)月：15.0 ± 1.9）相對(duì)于空白對(duì)照組（3 個(gè)月：2.1 ± 1.9；6 個(gè)月：5.1 ± 0.5）在不同的時(shí)間點(diǎn)都獲得了更好的修復(fù)效果，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）（圖 7B）。

3 個(gè)月 6 個(gè)月3 months 6 months空白對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 空白對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組Blank control group Experimental group Blank control group Experimental group H&E甲苯胺藍(lán)Toluidine blue天狼猩紅Sirius redA

Figure 7 H&E staining, toluidine blue staining, sirius red staining (A) and histologcal grading results of repair region of knee joints (B) (*significant different between two groups,< 0.05)

2.5 糖胺多糖的測(cè)定

糖胺多糖的定量檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組（3 個(gè)月：68.7 ± 5.1 μg/樣本；6 個(gè)月：132.7 ± 9.0 μg/樣本）無論在術(shù)后 3 個(gè)月還是 6 個(gè)月，均要顯著高于空白對(duì)照組（3 個(gè)月：18.3 ± 7.1 μg/樣本；6 個(gè)月：38.3 ± 10.0 μg/樣本），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）（圖 8）。

糖胺多糖含量（μg/樣本）Quantification ofglycosaminoglycan (μg/sample)150100500空白對(duì)照組Blank control group實(shí)驗(yàn)組Experimental group 3 個(gè)月 6 個(gè)月 3 months 6 months

Figure 8 The quantification of glycosaminoglycan of repair region results (*< 0.05)

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)至今仍是醫(yī)學(xué)界面臨的重大難題之一。盡管軟骨修復(fù)方法很多，但是尚缺乏能夠獲得長(zhǎng)期有效修復(fù)效果的再生策略。本實(shí)驗(yàn)立足于組織工程再生理念，以人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，復(fù)合脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外取向支架，構(gòu)建的組織工程軟骨復(fù)合體，成功地實(shí)現(xiàn)了山羊膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)的全層軟骨缺損的修復(fù)，證實(shí)了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外取向支架構(gòu)建的組織工程軟骨用于軟骨損傷修復(fù)的可行性。

近年來，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因其不但具有成體干細(xì)胞多項(xiàng)分化潛能的一般特性，還具有多方面的優(yōu)勢(shì)，如細(xì)胞的分離操作簡(jiǎn)單、不需酶的消化或其他的提純步驟就能夠獲得細(xì)胞表型更均一的細(xì)胞、對(duì)宿主無侵入性損傷、無倫理學(xué)爭(zhēng)議、細(xì)胞來源不受限等，迅速成為組織工程領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一[9-10]。在分離培養(yǎng)過程中，不需經(jīng)過體外酶的組織消化，這使得獲得的種子細(xì)胞表型更加均一。光鏡下觀察呈現(xiàn)纖維細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞表面抗原高表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記 CD34、CD45、HLA-DR。且細(xì)胞分離過程簡(jiǎn)單，干細(xì)胞的獲取效率高。在我們實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，細(xì)胞復(fù)合在支架后 3 d，共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞已經(jīng)布滿整個(gè)支架，且死/活細(xì)胞染色結(jié)果證實(shí)細(xì)胞在三維支架中生長(zhǎng)良好，幾乎無死亡細(xì)胞出現(xiàn)。異種細(xì)胞的移植實(shí)驗(yàn)往往存在免疫排斥反應(yīng)，但是本實(shí)驗(yàn)術(shù)后3 d 的關(guān)節(jié)液檢測(cè)結(jié)果卻顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的關(guān)節(jié)炎癥無明顯差異。這可能和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞相對(duì)于成體間充質(zhì)干細(xì)胞更為幼稚，免疫原性更低有關(guān)。

另外，和傳統(tǒng)應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)軟骨損傷的研究方法不同，本實(shí)驗(yàn)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞沒有進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)。但是從體內(nèi)修復(fù)結(jié)果中證實(shí)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組獲得了很好的修復(fù)效果。從大體觀察及組織學(xué)層面結(jié)果均證實(shí)，未經(jīng)過誘導(dǎo)成軟骨的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外取向支架構(gòu)建的組織工程軟骨能夠?qū)崿F(xiàn)全層軟骨缺損的修復(fù)。在 6 個(gè)月甲苯胺藍(lán)組織學(xué)染色結(jié)果中可見實(shí)驗(yàn)組修復(fù)區(qū)已有大量的成熟細(xì)胞外基質(zhì)分泌；天狼猩紅染色結(jié)果可見實(shí)驗(yàn)組修復(fù)區(qū)組織膠原成分和正常組織非常相近。另外，糖胺多糖定量檢測(cè)結(jié)果也顯示，實(shí)驗(yàn)組糖胺多糖含量遠(yuǎn)高于對(duì)照組。這說明不經(jīng)過成軟骨誘導(dǎo)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞也能夠獲得較好的體內(nèi)軟骨修復(fù)效果。這一研究結(jié)果與前期研究，認(rèn)為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞較其他成體組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞具有更好的軟骨分化潛能結(jié)論相吻合[11-12]。研究認(rèn)為這可能與人臍帶組織中富含透明質(zhì)酸有密切關(guān)聯(lián)。透明質(zhì)酸也是軟骨組織中的固有的天然成分，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在添加透明質(zhì)酸的細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境中能夠增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化作用[13-14]，這可能是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞更容易向軟骨分化的原因之一。在我們的試驗(yàn)中，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是復(fù)合在脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向支架中，該支架材料包含了大量的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原成分、糖胺多糖及透明質(zhì)酸等，有利于細(xì)胞的黏附、增殖和分化[15]。支架的取向仿生結(jié)構(gòu)有利于引導(dǎo)種子細(xì)胞定向分布，提高新生組織的力學(xué)性能[16]。因此，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)取向支架構(gòu)建的組織工程軟骨是很有應(yīng)用前景的組織工程軟骨修復(fù)策略。另外一些研究結(jié)果也顯示，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞也具有很好的生物調(diào)節(jié)作用，通過分泌生物活性物質(zhì)，如趨化因子和分化因子，促進(jìn)周圍組織細(xì)胞的遷移、增殖和分化，為軟骨修復(fù)提供良好的微環(huán)境，促進(jìn)損傷軟骨的修復(fù)[17-18]。綜合以上各種因素，共同促進(jìn)了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外取向支架構(gòu)建的組織工程軟骨對(duì)損傷軟骨的修復(fù)作用。

本實(shí)驗(yàn)旨在探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外取向支架構(gòu)建組織工程軟骨修復(fù)大動(dòng)物（山羊）膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨損傷的可行性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該方法行之有效，而且極具臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用前景。但本研究沒有進(jìn)行人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)軟骨損傷的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸機(jī)制方面的探索，修復(fù)有效性的觀察時(shí)間也相對(duì)較短。因此，我們下一步研究重點(diǎn)將主要關(guān)注在人臍帶干細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸機(jī)制，并進(jìn)一步觀察其遠(yuǎn)期的修復(fù)效果，為臨床的轉(zhuǎn)化與應(yīng)用提供更為有力的證據(jù)。

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Repair of goat full-thickness cartilage defects using tissue engineering cartilage constructed by the ACECM-oriented scaffold seeded with hUCSCs

ZHANG Yu, LIU Shu-yun, GUO Wei-min, HAO Chun-xiang, WANG Ming-jie, YUAN Zhi-guo, HUANG Jing-xiang, SUI Xiang, ZHANG Li, LU Shi-bi, GUO Quan-yi

Gj

Objective To explore the effectiveness of human umbilical cord derived stem cells (hUCSCs) combined with the acellular cartilage extracellular matrix oriented scaffold on the repair of full-thickness cartilage defects in big animal (goat).Methods hUCSCs were acquired from human umbilical cords. The oriented scaffold was made from acellular cartilage extracellular matrix of swine in our laboratory. The full-thickness and 6.5 mm diameter cartilage defects were made in the knee weight-bearing area (medial and lateral articular condyle) of adult goats. All of goats were randomly divided into two groups, including control group and experimental group (hUCSCs combined with the acellular cartilage extracellular matrix oriented scaffold treatment group). 7 and 14 d after operation, synovial fluid was extracted to demonstrate the inflammation. After 3 or 6 months, the two groups of animals were euthanized to analysis on gross morphology and histopathology.Results ①The results from H&E staining of synovial fluid smears showed that there was no significant difference in the inflammatory response of knee joint between the two groups. ②The gross morphology and histology staining confirmed that the regenerated articular cartilage of the experimental group was closer to the natural cartilage and had better integration with the surrounding area and better repairing effect. What’s more, the grade scores of the gross morphology and histopathology were higher in the experimental group than that of the control group in both 3 and 6-month (< 0.05). ③The results of quantitative detection of glycosaminoglycans in the experimental group were significantly higher than those in the control group (< 0.05).Conclusion The tissue engineering cartilage is constructed by hUCSCs combined with the acellular cartilage extracellular matrix oriented scaffold and repairs successfully the full-thickness cartilage defect in caprine model, and this method is a promise strategy on regeneration of cartilage in future.

Mesenchymal stem cell; Extracellular matrix; Tissue scaffolds; Tissue engineering; Cartilage, articular

GUO Quan-yi, Email: doctorguo_301@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.06.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（81472092）；國(guó)家高技術(shù)發(fā)展研究計(jì)劃（863 計(jì)劃）（2015AA020303）

100853 北京，中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院骨科研究所/骨科再生醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/全軍骨科戰(zhàn)創(chuàng)傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（張雨、劉舒云、郭維民、王明杰、苑志國(guó)、黃靖香、眭翔、張莉、盧世璧、郭全義），麻醉科（郝春香）

郭全義，Email：doctorguo_301@163.com

2016-10-10

Author Affiliations: Institute of Orthopaedics, Beijing Key Lab of Regenerative Medicine in Orthopaedics, Key Lab of Musculosketal Traums & Injurious PLA (ZHANG Yu, LIU Shu-yun, GUO Wei-min, WANG Ming-jie, YUAN Zhi-guo, HUANG Jing-xiang, SUI Xiang, ZHANG Li, LU Shi-bi, GUO Quan-yi); Anesthesia Department (HAO Chun-xiang), Chinese PLA General Hospital, 100853 Beijing, China