微生物轉化燈盞乙素制備野黃芩素的研究

鄭晨，沈琪華，董志紅，梅建鳳，易喻，應國清

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微生物轉化燈盞乙素制備野黃芩素的研究

鄭晨，沈琪華，董志紅，梅建鳳，易喻，應國清

目的 野黃芩素較其糖苷——燈盞乙素具有更好的生理活性，開發將燈盞乙素轉化為野黃芩素的生物轉化工藝具有潛在的應用價值。方法 篩選專一性高的微生物菌株，利用其發酵清液作為粗酶液轉化燈盞乙素為野黃芩素，優化產酶發酵培養基和轉化條件，提高野黃芩素轉化得率和產率。結果 篩選到一株黑曲霉 JH-2 菌株，該菌株產酶轉化燈盞乙素為野黃芩素的專一性較高，產物降解性弱；優化后的較佳培養基組成為：蔗糖 20 g/L，(NH4)2SO45 g/L，酵母浸出粉 3 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO40.01 g/L，pH 6.0；經轉化條件優化后，提高了底物濃度和產物得率，在底物濃度為 3 g/L，35 ℃下轉化 12 h，野黃芩素的得率可達 93.7%。結論 成功開發了一種簡便高效的野黃芩素制備方法，具有一定的應用價值。

生物轉化； 黑曲霉菌； 野黃芩素； 燈盞乙素

野黃芩素（scutellarein），又名高黃芩素、黃芩苷元和黃芩黃素等，屬黃酮類化合物。野黃芩素的 7-O-β-葡萄糖醛酸苷即燈盞乙素（breviscapine），又名燈盞花乙素、野黃芩苷和黃芩素苷等[1]。燈盞乙素具有抗血小板凝聚、抗腦缺血、抗心肌缺血、松弛血管、抑制細胞增殖、抗高血壓、抗氧化和抗糖尿病等藥理作用，臨床可用于治療心腦血管疾病、胎兒宮內生長遲緩、肺心病、糖尿病和藥物性肝損傷等，醫療用途十分廣泛[2-3]；并且，燈盞乙素對羥自由基、超氧陰離子和過氧化氫均有良好的清除作用，可能通過抑制氧化應激和增強機體抗氧化防御功能或其他途徑來防治糖尿病腎病以及抗 HIV-1[4-5]。但是，燈盞乙素存在溶解性差、生物利用度低、體內半衰期短等問題[6]。近年來對燈盞乙素的體內代謝研究發現，野黃芩素才是燈盞乙素的活性代謝物，具有更強的生物活性，而且它口服易于吸收，體內代謝更穩定，生物利用度是燈盞乙素的 3 倍多[6-7]。因此，近年來對野黃芩素的研究、開發和利用倍受人們關注。

野黃芩素的天然來源較為缺乏，僅存在少數幾種植物中，且含量極低[8]，難以實現大規模生產；目前已有化學方法全合成野黃芩素[9]，但合成步驟較長，收率偏低。相比之下，燈盞乙素在一些植物中含量則較高，如燈盞細辛、小飛蓬、黃芩和側花黃芩等[1]，可以從這些植物中大量獲取，因此，可以通過化學或生物方法轉化燈盞乙素為野黃芩素。目前，已有這方面的研究報道和專利申請[10-12]，但都存在一定的不足，如酸水解法往往對苷元結構造成破壞，分離純化困難，且轉化率低，造成酸排放污染；生物轉化法存在底物濃度不高，生產得率低等問題。為了克服目前現有野黃芩素生產方法的不足，本文采用微生物法轉化燈盞乙素為野黃芩素（圖 1），選擇了一株轉化能力較高的微生物菌株，經產酶發酵和轉化條件優化后，生產效率較現有研究有顯著提高。

燈盞乙素 野黃芩素

Figure 1 Scheme of breviscapine to scutellarein by biotransformation

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 轉化菌株 黑曲霉（）XW-2（CCTCC M2011358）、MJ（CCTCC M2013329）和 JH-2（CCTCC M2014398）菌株由前期研究實驗獲得，均保藏于中國典型培養物保藏中心；黑曲霉 ZC03、ZC04、ZC08、ZC11 和 ZC14 菌株從土壤中分離（經 18s rDNA 序列分析鑒定）。

1.1.2 試劑 燈盞乙素標準品購自西安開來生物工程有限公司（批號 K150222，純度 98%）；野黃芩素標準品購自上海源葉生物科技有限公司（批號 KS0909CB14，純度 98%）；其他試劑均為市售分析純、色譜純或生物試劑。

1.1.3 儀器 LC-20AD 高效液相色譜儀為日本島津儀器有限公司產品；YXQ-LS-70A 高壓蒸汽滅菌鍋為上海博迅實業有限公司產品；SW-CJ-1BU超凈工作臺為蘇州安泰空氣技術有限公司產品；DHP-9402 恒溫培養箱為上海一恒科學儀器有限公司產品；HWY-2112 恒溫振蕩培養箱為上海智城分析儀器制造有限公司產品。

1.1.4 培養基 平板培養基采用馬鈴薯瓊脂培養基（PDA），種子培養基采用馬鈴薯液體培養基（PDB）[13]；初始產酶培養基的組成：蔗糖 10 g/L，(NH4)2SO43 g/L，酵母浸出粉 2 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO40.01 g/L，pH 6.0。所有培養基經 121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 微生物培養 菌種篩選時，挑取各菌株孢子直接接種 50 ml 產酶培養基；產酶條件優化時，挑取菌株孢子接種 50 ml 種子培養基，于 30 ℃，200 r/min 振蕩培養 2 d，再移取種子液 2.5 ml 接種 50 ml 產酶培養基。接種后的產酶培養基于30 ℃，200 r/min 振蕩培養 3 d。

1.2.2 燈盞乙素的生物轉化 產酶培養結束后，培養物用布氏漏斗抽濾，取 9.5 ml 濾液（粗酶液）于 50 ml 三角瓶中；燈盞乙素用 0.5 ml 甲醇溶解加入粗酶液中，于 30 ℃、200 r/min 振蕩轉化 8 ~ 12 h。

1.2.3 燈盞乙素和野黃芩素的濃度分析 采用 HPLC 法分析燈盞乙素和野黃芩素濃度，色譜柱為Phenomenex Luna C18 鍵合硅膠柱（5 μm，250 mm ×4.6 mm）。色譜檢測條件：柱溫為室溫，流動相為體積比 9:1 的甲醇和 0.1% 的磷酸水溶液的混合物，流速 0.8 ml/min，檢測波長 335 nm，進樣量 20 μl。

轉化反應結束后，轉化液用 50 ml 乙酸乙酯萃取 2 遍，乙酸乙酯分液于圓底燒瓶中，減壓蒸干乙酸乙酯后用 2 ml 甲醇溶解殘留物，經適當倍數稀釋和 0.45 μm 微孔濾膜過濾后，用 HPLC 分析樣品中燈盞乙素和野黃芩素濃度，由相同分析條件下的標準品濃度-峰面積標準曲線計算樣品中兩者的濃度。

2 結果

2.1 轉化菌株的篩選

黑曲霉的產糖苷酶的能力較強，是天然糖苷生物轉化常用的菌種，所以選擇了 8 株黑曲霉轉化燈盞乙素，在底物濃度為 1 g/L，30 ℃下轉化 8 h 后，不同菌株發酵制備的粗酶液轉化樣品中野黃芩素的濃度和轉化得率見表 1。

表 1 不同黑曲霉菌株轉化燈盞乙素生成野黃芩素的濃度和得率

由表 1 可見，所有菌株均能產酶轉化燈盞乙素為野黃芩素，相比之下，JH-2 菌株的轉化得率最高，達到 56.9 %。此時，轉化體系中還殘留大量燈盞乙素，說明底物未被水解成其他化合物，轉化專一性良好。進一步優化產酶培養條件和轉化條件，轉化得率能得以提高。

2.2 產酶培養基主要成分濃度優化

以黑曲霉 JH-2 菌株為轉化菌株，在初始產酶培養基的基礎上，考察了培養基主要成分的濃度，即蔗糖、(NH4)2SO4和酵母浸出粉的濃度對野黃芩素得率的影響，在底物濃度為 1 g/L，30 ℃下轉化 8 h 后，野黃芩素轉化得率見圖 2、圖 3 和圖 4。

野黃芩素得率（%）Yield of scutellarein (%)80706050403020 5 10 15 20 25 30 蔗糖濃度（g/L）Concentration of sucrose (g/L)

Figure 2 Effects of sucrose concentration on the yield of scutellarein

野黃芩素得率（%）Yield of scutellarein (%)9080706050 2 3 4 5 6 (NH4)2SO4濃度（g/L）Concentration of (NH4)2SO4 (g/L)

Figure 3 Effects of (NH4)2SO4concentration on the yield of scutellarein

野黃芩素得率（%）Yield of scutellarein (%)95908580757065 1 2 3 4 5 酵母浸出粉濃度（g/L）Concentration of yeast extracts (g/L)

Figure 4 Effects of yeast extracts concentration on the yield of scutellarein

由圖 2 可見，當蔗糖濃度提高到 20 g/L 時，野黃芩素的轉化得率最高，達到了 72.5%。如蔗糖濃度繼續提高，菌體生物量雖然有明顯增加，但野黃芩素的轉化得率反而降低，這可能是因為菌體生長過旺，一些水解野黃芩素的酶類活性增加，如轉化時間較長，野黃芩素就被降解。

由圖 3 可見，當 (NH4)2SO4濃度從 2 g/L 增加到 5 g/L 時，野黃芩素的轉化得率隨 (NH4)2SO4濃度增加而提高，之后便不再增加，所以較佳的(NH4)2SO4濃度為 5 g/L，此時野黃芩素的轉化得率為84.4%。

由圖 4 可見，酵母浸出粉濃度對野黃芩素的轉化得率有顯著影響，從 1 g/L 增加到 3 g/L 時，野黃芩素的轉化得率隨之提高，所以較佳的酵母浸出粉濃度為 3 g/L，此時野黃芩素的轉化得率為91.3%。考慮到利用此組成的培養基，野黃芩素的轉化得率已經達到 91.3%，所以未對其他成分和 pH 進行優化。經上述優化后培養組成為：蔗糖 20 g/L，(NH4)2SO45 g/L，酵母浸出粉 3 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO40.01 g/L，pH 6.0。

2.3 轉化溫度對野黃芩素得率的影響

酶催化過程需要一個適宜的溫度范圍，溫度偏高或偏低均會影響酶的活力，繼而影響反應過程的速度和產物的得率，為此考察了轉化溫度對野黃芩素得率的影響，在底物濃度為 1 g/L，不同溫度下轉化 8 h 后，野黃芩素的得率見圖 5。

野黃芩素得率（%）Yield of scutellarein (%)100908070605040 25 30 35 40 45 轉化溫度（℃）Biotransformation temperature (℃)

Figure 5 Effects of biotransformation temperature on the yield of scutellarein

由圖 5 可見，轉化溫度在 30 ~ 35 ℃之間，野黃芩素得率基本穩定，高于或低于這個溫度范圍，轉化得率顯著降低。

2.4 底物濃度對野黃芩素得率的影響

為了提高轉化產率，對底物燈盞乙素濃度進行了優化，黑曲霉 JH-2 菌株產酶培養制備的粗酶液轉化燈盞乙素，在不同底物濃度下，35 ℃下轉化 8 h 后，野黃芩素的得率見圖 6。

由圖 6 可見，隨著燈盞乙素濃度的提高，野黃芩素的轉化得率逐漸下降。在燈盞乙素濃度 1 ~ 3 g/L 時，野黃芩素的得率下降并不顯著，在 3 g/L 時，得率為 83.1%。

野黃芩素得率（%）Yield of scutellarein (%)958575655545 1 2 3 4 5 燈盞乙素濃度（g/L）Concentration of breviscapine (g/L)

Figure 6 Effects of breviscapine concentration on the yield of scutellarein

2.5 轉化時間對野黃芩素得率的影響

在底物濃度提高的情況下，產物的轉化得率與轉化時間有很大關系，延長轉化時間或許能提高轉化得率。在底物濃度為 3 g/L，35 ℃條件下，轉化時間對野黃芩素得率的影響見圖7。

由圖 7 可見，隨著轉化時間的延長，野黃芩素的得率逐漸提高，轉化 12 h 時，轉化體系中野黃芩素的濃度為 1.74 g/L，轉化得率為93.7%；之后則有下降趨勢，說明粗酶液中還存在一些野黃芩素的水解酶，轉化時間過長則導致野黃芩素的水解。圖 8 是燈盞乙素經 12 h 轉化后HPLC 分析圖譜，可以看出燈盞乙素僅有少量殘留，野黃芩素的轉化得率較高。

3 討論

腸道菌群代謝對糖苷類的藥效發揮起到重要作用，但并不是所有的糖苷都能被腸道菌分解成苷元而吸收利用。體外生物轉化技術的應用，對開發以苷元為藥效物質基礎的高效制劑具有巨大的應用價值。由于微生物種類繁多、酶系豐富，制備容易等優點，微生物酶源的生物轉化在糖苷轉化中的應用，是中藥生物技術研究領域的一個熱點內容。近些年來，中藥糖苷成分的體外生物轉化研究已有較多報道與應用，如人參皂苷[14]，但還有許多糖苷尚未得以研究開發。本文篩選出一株黑曲霉菌株 JH-2，能將燈盞乙素轉化為野黃芩素，且專一性良好，經轉化工藝優化后，可以獲得較高的野黃芩素轉化得率，具體工藝流程為：黑曲霉 JH-2 孢子接種 PDB 種子培養基，于 30 ℃，200 r/min 振蕩培養 2 d，移取 5% 體積分數的種子液接種產酶培養基。經接種的產酶培養基于 30 ℃，200 r/min 振蕩培養 3 d。產酶培養結束后，去除菌體的濾液中加入 3 g/L 的燈盞乙素，于 35 ℃、250 r/min 下轉化 12 h，野黃芩素的轉化得率可達 93.7%。較佳的產酶培養基組成為：蔗糖 20 g/L，(NH4)2SO45 g/L，酵母浸出粉 3 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO40.01 g/L，pH 6.0。本文研究結果對野黃芩素的開發利用提供了新的方向，方法具有工藝簡單，生產周期短、副產物少等優點，具有一定的應用前景。

野黃芩素得率（%）Yield of scutellarein (%)100806040200 2 4 6 8 10 12 14 16 轉化時間（h）Biotransformation time (h)

Figure 7 Effects of biotransformation time on the yield of scutellarein

時間（min）

Time (min)

1：燈盞乙素和野黃芩素標準品；2：轉化 0 h 對照；3：轉化 12 h 樣品

1: Standard breviscapine and scutellarein; 2: Breviscapine without biotransformation; 3: A sample after biotransformation for 12 h

圖 8 生物轉化燈盞乙素為野黃芩素 HPLC 分析圖譜

Figure 8 HPLC chromatograms of breviscapine and scutellarein after biotransformation

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Microbial transformation of breviscapine to scutellarein

ZHENG Chen, SHEN Qi-hua, DONG Zhi-hong, MEI Jian-feng, YI Yu, YING Guo-qing

Gj

Objective To develop a process for biotransformation of breviscapine to scutellarein for its potential applications in the pharmaceutical industry.Methods Microbial strains were screened for selecting one with high specificity for biotransformation. The medium for producing enzyme and optimization of the biotransformation conditions were carried out to improve the yield and productivity.Results A strain designated as JH-2 was selected from eight strains ofto produce scutellarin with high specificity and low biodegradability. The optimized medium was composed of 20 g/L sucrose, 5 g/L (NH4)2SO4, 3 g/L yeast extracts, 1 g/L KH2PO4, 0.5 g/L MgSO4and 0.01 g/L FeSO4with initial pH at 6.0. After optimization of the biotransformation conditions, the yield reached 93.7% when the concentration of substrate was 3 g/L, and the biotransformation was conducted at 35 ℃ for 12 h.Conclusion The process developed in the study is simple and efficient with potential applications in the pharmaceutical industry.

Biotransformation;; Scutellarein; Breviscapine

MEI Jian-feng, Email: mrion@zjut.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.06.007

310014 杭州，浙江工業大學藥學院

梅建鳳，Email：mrion@zjut.edu.cn

2016-09-23

Author Affiliation: College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China