體外震波對人臍靜脈內皮細胞增殖、細胞周期及細胞間黏附因子-1表達的影響

馬一銘,李麗,蔡紅雁,胡釗,郭濤

基礎與實驗研究

體外震波對人臍靜脈內皮細胞增殖、細胞周期及細胞間黏附因子-1表達的影響

馬一銘,李麗,蔡紅雁,胡釗,郭濤

目的:觀察體外震波治療對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)增殖、細胞周期及細胞間黏附因子-1(ICAM-1)表達的影響。

方法:將體外培養的人臍靜脈內皮細胞分組,實驗部分分別給予0.03、0.09、0.18、0.24 mJ/mm2能量震波500擊處理(分別設定為0.03、0.09、0.18、0.24 mJ/mm2能量組),對照組不給予震波處理。細胞計數試劑盒(CCK)比色法檢測細胞增殖情況,流式細胞術檢測細胞周期,實時定量聚合酶鏈反應(PCR)及蛋白質印跡方法(Westen blot)分別檢測低能量震波處理后ICAM-1信使核糖核酸( mRNA) 和蛋白的表達水平。

結果:CCK 比色法檢測結果顯示:只有0.09 mJ /mm2能量組與對照組比能促進HUVECs增殖,且差異有統計學意義(P<0.05),而其他能量組與對照組比,差異均無統計學意義(P>0.05)。不同能量組與對照組比較,0.09 mJ/mm2能量組G0/G1期細胞比例明顯減少(P<0.05),S期和G2/M期細胞比例明顯增加(P<0.05),0.03 mJ/mm2能量組僅增加G2/M期細胞比例(P<0.05),而其他能量組與對照組比差異均無統計學意義(P>0.05)。實時定量PCR檢測顯示:0.09 mJ/mm2能量組ICAM-1 mRNA表達均較對照組明顯增高(9.27±0.95 vs 1.02±0.27,P<0.001),0.03 mJ/mm2能量組ICAM-1 mRNA表達均較對照組亦增高(7.08±0.60 vs 1.02±0.27,P<0.01)。Westen blot檢測顯示:0.09 mJ/mm2能量組ICAM-1蛋白表達較對照組明顯增高,差異有統計學意義(P<0.05)。

結論:體外震波治療,特別是0.09 mJ/mm2能量的體外震波能加速HUVECs細胞周期由G0期/G1期向S期和G2/M期的轉換,促進細胞增殖,并且提高ICAM-1的表達,這在體外震波促進血管新生機制中起重要作用。

體外震波治療;臍靜脈;內皮細胞;細胞周期

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:1013.)

體外震波作為物理療法,已成功運用于泌尿系結石、膽道結石、骨骼肌肉系統疾病、肩周炎、糖尿病足等多年,近年來發現體外震波能促進血管新生用于冠心病治療,改善心肌缺血。目前國內外已在細胞水平、動物實驗、臨床水平證實了其促血管新生的確切療效,且有效能量級別為0.09 mJ /mm2(相當于體外震波碎石能量的1/10)[1-4],但其顯效機制目前尚不明確。血管內皮細胞是血管形成的基礎,在血管形成的過程中起最重要作用[5-7],可以說內皮細胞增殖是血管形成的先決條件,促進血管內皮細胞的增殖能提高血管新生。但血管新生過程復雜,還需要多種細胞因子的參與,細胞間粘附因子-1(ICAM-1)可在增生的內皮細胞高度表達,介導細胞與細胞間或細胞與基質間相互接觸和結合從而加速血管新生[8]。體外震波能否促進血管內皮細胞增殖和ICAM-1的表達進而促進血管新生,值得我們進一步研究,故本實驗從細胞水平探討體外震波促進血管新生的有效能量,觀察其對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)細胞增殖、細胞周期及ICAM-1表達的影響,探討低能量體外震波促血管新生的可能機制,進一步尋找體外震波促血管新生的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

胎牛血清白蛋白(美國Hyclone公司), HUVECs(中國科學院昆明動物研究所),DMEM培養基(美國Hyclone 公司),0.25% 胰蛋白酶(美國Gibco公司),青鏈霉素(美國Sigma公司),細胞計數試劑盒(CCK,日本Dojindo公司),細胞周期檢測試劑盒(美國Beckmam Coulter公司),二喹林甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(杭州碧云天公司),鼠抗人ICAM-1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司),山羊抗鼠HRP標記IgG抗體(美國Santa Cruz公司),核糖核酸(RNA)抽提試劑盒(德國Qiagen公司), cDNA合成試劑(德國Promege公司),聚合酶鏈反應(PCR)定量反應試劑盒(德國Qiagen公司),引物(上海生物工程公司),10XLoading Buffer(DNA)(日本TaKaRa公司),ELX800酶標儀(美國Chernicon公司),SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜裝置(美國Bio-Rad公司),PCR擴增儀(7300型,美國ABI公司),流式細胞儀(美國Becman Coulter公司)。

1.2細胞培養

將購于中國科學院昆明動物研究所的HUVECs培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中,置于37℃,5%CO2孵箱培養3 d,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS,濃度0.01 mol/L,pH=7.4,含NaCl、Na2HPO4、KCl、KH2PO4) 洗掉非貼壁細胞,按1:3的比例傳代。

1.3HUVECs分組與震波處理

將培養至對數生長期細胞用0.25%的胰蛋白酶消化,用10%胎牛血清的DMEM培養基制成細胞懸液,調節細胞濃度為1X105/ml,分別置于5支2 ml試管中,培養24 h,使細胞同步化并隨機分組處理。采用瑞士STORZMEDICAL公司生產的震波儀(MODULITHSLC)進行震波處理,實驗部分分別給予0.03、0.09、0.18、0.24 mJ/ mm2能量震波500擊處理(分別設定為0.03、0.09、0.18、0.24 mJ/mm2能量組),對照組置于震波儀器中但不進行震波處理,繼續培養細胞24 h,進行后續檢測。

1.4CCK檢測HUVECs增殖情況

各組細胞懸液加入96孔板中( 100 μl/孔),再向每孔加入10 μl的CCK溶液,將培養板在(37℃, 5%CO2) 培養箱內孵育4 h,用酶標儀測定在波長450 nm 處的吸光度值(A450),用吸光度值表示細胞增殖能力[9]。

1.5 流式細胞儀術檢測HUVECs細胞周期的分布情況

將各細胞懸液收集于15 ml試管中,以626 g離心5 min,加少量DMEM培養液,計數,各組細胞量約1X105,收集沉淀重懸于200 μl的PBS中,再次離心收集沉淀,75%冰凍乙醇4℃固定細胞,離心棄固定液,再加PBS離心洗滌1次,沉淀重懸于200～500 μl的PBS,加入RnaseA 37℃水浴l h,加入碘化丙啶(PI)染色,終濃度50 ng/ml,4℃避光30 min,過300目篩網流式細胞儀檢測細胞周期[10]。

1.6 蛋白質印跡方法(Westen blot)檢測

提取震波后各組細胞總蛋白,用BCA法[11]測定總蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品上樣,聚丙稀銑胺凝膠電泳(SDSPAGE),電轉移90 min至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,5%脫脂奶粉封閉2 h后與ICAM-1(1:6 000)一抗4 ℃孵育過夜。與山羊抗鼠辣根過氧化物酶(HRP)標記IgG抗體(1:10 000)二抗室溫孵育1 h后,再與化學發光試劑(ECL)室溫作用3 min,后曝光、顯影和定影。

1.7 實時定量PCR法檢測

提取并純化震波后各組HUVECs細胞RNA,按照MBI公司逆轉錄試劑盒操作明合成cDNA,利用primer premier 5.0 軟件設計引物,引物(上海生物工程公司合成):ICAM-1 (正義鏈) 5'-tccagacatgaccgctgagt-3',(反義鏈) 5'-ctcattggccaacctgcctt-3',擴增片段長度為210 bp; GAPDH( 正義鏈) 5'-caaggtcatccatgacaactttg-3',(反義鏈) 5'-gtccaccaccctgttgctgtag-3',擴增片段長度為496 bp,設定反應條件進行PCR反應。瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像、掃描,紫外燈下觀察結果并拍照記錄。用GAPDH 基因為內參基因,ICAM-1樣品目的基因的相對表達率(RQ) 參照文獻[12]方法采用2-ΔΔCt法計算,公式如下:RQ = 2-ΔΔCt;ΔΔCt =待測樣本目的基因ΔCt-對照組目的基因ΔCt;ΔCt =目的基因Ct-內參基因Ct。

1.8 統計學處理

應用SPSS 17.0 統計軟件進行數據分析。實驗數據以均數±標準差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 體外震波治療對HUMVCs增殖的影響(圖1)

不同能量組與對照組比較,0.09 mJ /mm2能量組增殖能力較對照組升高(吸光度值升高),且差異有統計學意義(P<0.05);而0.03、0.18、0.24 mJ /mm2能量組的增殖能力( 0.60 ± 0.06、0.62 ± 0.06、0.58 ±0.04) 與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 不同震波能量級別對HUVECs增殖的影響

2.2 體外震波治療對HUMVCs細胞周期分布的影響(表1)

0.09 mJ/mm2能量組與對照組相比,G0 /G1期細胞比例降低[(53.16±5.89)% vs (71.30±4.95)%, P<0.05],S期及G2/M期細胞比例明顯升高[(39.05±5.25)% vs (25.01±5.39)%、(8.21 ±1.44)% vs (4.03±0.73)%],且差異有統計學意義(P<0.05)。0.03 mJ/mm2能量組僅G2/M期細胞比例高于對照組[(5.69±0.93)% vs (4.03±0.73)%, P<0.05]。其余各組細胞周期比例較對照組均無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組HUVECs的細胞周期分布比例(n= 6,)

表1 各組HUVECs的細胞周期分布比例(n= 6,)

注: HUVECs:人臍靜脈內皮細胞。與對照組相比*P<0.05

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2.3 實時定量PCR檢測ICAM-1 mRNA的表達(圖2)

瓊脂糖凝膠電泳顯示,ICAM-1 PCR反應所得的產物條帶均與預期擴增產物的長度一致,無明顯雜帶,擴增曲線以"S"型為擴增成功。與對 照 組 相 比,0.09 mJ/mm2能 量 組HUVECs ICAM-1mRNA的表達明顯增加[(9.27±0.95) vs (1.02±0.27),P<0.001];0.03 mJ/mm2能 量組亦能增加ICAM-1 mRNA的表達(7.08±0.60 vs 1.02±0.27,P<0.01),但不如0.09 mJ/mm2能量組明顯。

圖2 體外震波對HUVECs ICAM-1 mRNA表達的影響

2.4 Western blot檢測ICAM-1蛋白的變化(圖3)

與 對 照 組 相 比,0.09 mJ/mm2能 量 組 處理HUVECs時ICAM-1蛋 白 表 達 明 顯 增 加[(132.32±14.43) vs (100.00±0.00),P<0.05], 其余能量組與對照組比較差異無統計學意義。

圖3 體外震波對HUVECs ICAM-1蛋白表達的影響

3 討論

目前,冠心病已經成為人類疾病死亡的主要原因,嚴重危害人類健康,當心肌發生缺血、壞死時,機體可代償性的促進內皮細胞增殖、遷移,從而促進梗死周圍區側枝循環的建立,但這種微循環的重建代償不足以滿足機體改善心肌供血的需要[13]。尋找新的無創方法通過人為因素來促進缺血區血管新生,從而改善缺血組織的血液供應,已經成為近年來心血管疾病治療研究的熱點方向。近年來發現體外震波作為一種新型的血管再生療法,通過低能量脈沖波對心肌及血管內皮細胞產生剪切力和空穴效應,能夠刺激新生血管形成,提高局部心肌血流和毛細血管密度[1,2]。體外震波能夠增加缺血心肌供血,減輕冠心病患者心絞痛癥狀,減少硝酸酯類用量,改善心功能,期間未發現明顯不良反應,初步證實其安全有效[3,14],但其具體機制仍然不清楚,仍需我們不斷研究。

本研究采用能夠近似反映人類血管內皮細胞真實情況的HUVECs進行實驗,結果發現0.09 mJ / mm2500擊低能量震波能加速HUVECs細胞周期由G0/G1期向G2/M期和S期的轉換,增加S期及G2/ M期細胞數,從而促進細胞增殖。0.09 mJ /mm2能量被認為最佳能量,這與國外報道類似[1,2,14],但對血管內皮細胞增殖、細胞周期的影響至今少見報道。而內皮細胞增殖同遷移、成熟和毛細血管形成一樣,是血管新生中極為重要的一環[15],因此認為體外震波可以通過誘導內皮細胞增殖來促進血管新生。

研究發現人為地增加心肌局部細胞生長因子的濃度,對緩解以致解除心肌缺血有潛在的可行性[16]。血管內皮生長因子( VEGF) 是促血管生成的重要調節因子,低能量體外震波能促進受損心肌組織高表達VEGF、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)等血管相關細胞因子,參與促進缺血心肌組織新生毛細血管的形成和側枝循環的建立[1,17,18]。研究還發現體外震波能促進具有分化成血管內皮細胞的間充質細胞(MSCs)的增殖、分化和旁分泌活動,參與血管新生[19-21]。ICAM-1屬于黏附因子中免疫球蛋白超家族(IGSF)中的成員,是介導黏附反應重要的一個黏附因子,ICAM-1廣泛分布于內皮細胞、單核細胞、中性粒細胞表面,內皮細胞上的細胞間黏附因子介導細胞與細胞間或細胞與基質間相互接觸和結合,從而參與細胞的信號轉導與活化、細胞組織生長及分化、免疫反應、炎癥反應、血管生成及腫瘤轉移等生理病理過程。

血管形成是一個復雜的過程,血管生成過程中需要血管內皮細胞與細胞外基質間、血管內皮細胞相互間及血管內皮細胞與其他周圍細胞間的相互作用,這種作用是黏附因子完成的,研究證明ICAM-1通過影響機體免疫抑制活性,有助于異位組織逃避機體免疫系統,促進異位組織侵入后的血管生成[22]。亦有研究發現ICAM-1介導白細胞與血管內皮細胞的黏附,促發炎性反應,一方面聚集的白細胞釋放大量炎性介質和化學物質,可引起血管內皮損傷,另一方面也可以促進缺血組織炎癥血管新生[23],炎癥反應對缺血組織的這種雙重作用以哪種為主與缺血的程度和時間相關。我們的研究結果顯示,體外震波處理HUVECs在0.03～0.09 mJ/mm2能量時促進ICAM-1mRNA的表達,而Western blot檢測發現只有0.09 mJ/mm2能量時才表達ICAM-1蛋白,出現這樣的結果可能與較低的能量使細胞出現的炎癥反應低,只出現基因水平的變化,而適宜的能量不僅出現基因水平的變化,而且出現蛋白質水平的變化,認為體外震波促進ICAM-1的表達在促進血管新生中起到重要作用,此時作為炎性因子正面作用更大。

本實驗結果顯示,體外震波能夠促進血管內皮細胞增殖,提高黏附因子ICAM-1的表達而參與血管新生,且0.09 mJ/mm2為最佳能量。但本實驗僅檢測了具有代表性的黏附因子ICAM-1,震波作用后與血管新生相關的其他細胞因子、酶、基因等也有待進一步研究。

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Effect of Extracorporeal Shock Wave on Proliferation, Cell Cycle and Intercellular Adhesion Molecule-1 Expression in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

MA Yi-ming, LI Li, CAI Hong-yan, HU Zhao, GUO Tao。
Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming (650000), Yunnan, China Corresponding Author: CAI Hong-yan, Email: hyflykm@sina.com。

Objective: To observe the effect of extracorporeal shock wave therapy (ESWT) on proliferation, cell cycle and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)。Methods: HUVECs were cultured in vitro at the concentration of (1X105/ml) and the cells were divided into 2 sets of groups: CSWT group, the cells were treated by different energy of (0.03, 0.09, 0.18, 0.24) mJ/mm2respectively and corresponding Control group, in which the cells had no CSWT。 HUVEC proliferation was detected by CCK colorimetric method, cell cycle was measured by flow cytometry, mRNA and protein expressions of ICAM-1 were examined by RT-PCR and Western blot analysis respectively。Results: Compared with Control group, (0.09 mJ/mm2) CSWT group had promoted HUVECs proliferation, P<0.05 and the other CSWT groups were similar to corresponding Control groups, P>0.05; (0.09 mJ/mm2) CSWT group showed decreasedproportion of G0/G1 stage and increased S and G2/M stages, all P<0.05; while (0.03 mJ/mm2) CSWT group only increased the proportion of G2/M stage, P<0.05 and the other CSWT groups were similar to corresponding Control group, P>0.05. Compared with Control group, (0.09 mJ/mm2) and (0.03mJ/mm2) CSWT groups showed increased mRNA expression of ICAM-1 (9.27±0.95) vs (1.02±0.27), P<0.001 and (7.08±0.60) vs (1.02±0.27), P<0.01; (0.09 mJ /mm2) CSWT group had elevated protein expression of ICAM-1, P<0.05.Conclusion: ESWT especially at (0.09 mJ/mm2) may accelerate cell cycle transition from G0/G1 stage to S and G2/M stages, promote HUVECs proliferation and increase ICAM-1 expression which may play important roles in ESWT facilitated angiogenesis in vitro。

Extracorporeal shock wave therapy; Human umbilical vein; Endothelial cells; Cell cycle;

2016-01-24)

(編輯:王寶茹)

國家自然科學基金項目(81260027);云南省衛生廳科技計劃項目(2012WS005);云南省科技計劃項目(2014FZ023);云南省科技廳-昆明醫科大學聯合專項基金(2013FB128)

650000 云南省昆明市,昆明醫科大學第一附屬醫院 心內科

馬一銘 碩士研究生 主要從事冠心病介入治療研究 Email:mymkm@sina.com 通訊作者:蔡紅雁 Email:hyflykm@sina.com

R54

A

1000-3614(2016)10-1013-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2016.10.016