人類免疫缺陷病毒/獲得性免疫缺陷綜合征肺脾氣虛證的病理機制研究

張 淼，馬素娜，張海燕，高 亮

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·論著·

·中醫·中西醫結合研究·

人類免疫缺陷病毒/獲得性免疫缺陷綜合征肺脾氣虛證的病理機制研究

張 淼，馬素娜，張海燕，高 亮

目的 探討人類免疫缺陷病毒(HIV)/獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)肺脾氣虛證患者載脂蛋白(Apo)AⅠ、ApoAⅡ、ApoB、鋅α2-糖蛋白(AZGP1)表達水平的差異，為研究HIV/AIDS中醫證候提供依據。方法 2013年12月—2014年6月選取河南省某地區的HIV/AIDS肺脾氣虛證患者28例為HIV/AIDS肺脾氣虛證組(FP組)。同期選取同地區健康人16例為對照組(JK組)。采集研究對象血清，檢測CD4、CD8水平及CD4/CD8，采用iTRAQ-MS技術鑒定ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平。結果 FP組CD4水平低于JK組，CD4/CD8小于JK組(P<0.05)；兩組CD8水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。兩組iTRAQ-MS技術鑒定ApoAⅠ水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；FP組iTRAQ-MS技術鑒定ApoAⅡ水平高于JK組，iTRAQ-MS技術鑒定ApoB、AZGP1水平低于JK組(P<0.05)。兩組ELISA法檢測ApoAⅠ水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；FP組ELISA法檢測ApoAⅡ水平高于JK組，ELISA法檢測ApoB、AZGP1水平低于JK組(P<0.05)。結論 HIV/AIDS肺脾氣虛證患者血清中ApoAⅡ水平升高，ApoB、AZGP1水平降低，與脂質代謝有關。

艾滋病；肺脾氣虛證；載脂蛋白

張淼，馬素娜，張海燕，等.人類免疫缺陷病毒/獲得性免疫缺陷綜合征肺脾氣虛證的病理機制研究[J].中國全科醫學，2016，19(33)：4083-4086.[www.chinagp.net]

ZHANG M,MA S N,ZHANG H Y,et al.Pathological mechanism of lung spleen qi deficiency syndrome in HIV/AIDS[J].Chinese General Practice，2016，19(33)：4083-4086.

本課題組近十多年一直致力于人類免疫缺陷病毒(HIV)/獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)中醫證候的研究，通過流行病學調查發現，肺脾氣虛證是HIV/AIDS常見虛證證型[1]，并通過專家問卷調查[1]、研制HIV/AIDS中醫證候診斷量表[2]、系統生物學研究[3-5]探索HIV/AIDS肺脾氣虛證的中醫病因、病理機制及證候的本質，為中醫藥防治AIDS提供思路和方法。蛋白質組學已被引入到中醫證候的研究，通過對證候蛋白質表達譜進行分析，進而揭示中醫證候的本質[6]。目前，蛋白質組學的研究主要集中于定量分析，在定量蛋白質組學領域，同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)是使用最廣泛的技術。本課題組運用蛋白質組學iTRAQ標記結合質譜(MS)技術[7]研究發現，HIV/AIDS肺脾氣虛證患者血清中載脂蛋白(Apo)AⅡ、ApoB、鋅α2-糖蛋白(AZGP1)表達水平存在差異[3]。本研究運用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法對差異表達蛋白進行驗證，以期發現HIV/AIDS肺脾氣虛證的生物標志物，闡釋HIV/AIDS肺脾氣虛證的機制，為中醫證候量化提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2013年12月—2014年6月選取河南省某地區的HIV/AIDS肺脾氣虛證患者28例為HIV/AIDS肺脾氣虛證組(FP組)。納入標準：西醫診斷標準參考《艾滋病診療指南(2011版)》[8]，有流行病學史，實驗室檢查HIV抗體陽性；中醫證候診斷標準參考本課題組研制的HIV/AIDS肺脾氣虛證中醫診斷量表，包括氣喘、易感冒、泄瀉、自汗、痰稀、胸悶、消瘦、惡風寒、心悸心慌、舌淡、脈虛弱等癥狀。排除標準：有嚴重感染者，意識不清、癡呆、各種精神類疾病者或不愿意合作者。同期選取同地區健康人16例為對照組(JK組)。納入標準：年齡18～60歲；無基礎疾病。排除標準：原發性免疫缺陷病、激素化療等引起的繼發性免疫缺陷病、血液病、其他原因引起的中樞神經系統疾病；意識不清、癡呆、各種精神類疾病者或不愿意合作者。FP組男13例，女15例；年齡31～60歲，平均年齡(50.2±6.7)歲。JK組男8例，女8例；年齡30～57歲，平均年齡(47.6±6.9)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義(χ2=0.015，P=0.902；t=1.332，P=0.195)。研究對象均簽署知情同意書，本課題經過傳染病國家科技重大專項“十二五”計劃小組多輪評審通過并批準。

1.2 研究方法 采集研究對象清晨空腹血液5 ml，靜置30 min，3 000 r/min離心5 min(離心半徑20 cm)，取上清液，放入-80 ℃冰箱備用。

1.2.1 檢測CD4、CD8水平及CD4/CD8采用FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)檢測CD4、CD8水平，計算CD4/CD8。

1.2.2 iTRAQ-MS技術鑒定ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平 依據iTRAQ實驗要求，每組設立4個生物學重復，利用安捷倫親和離心小柱Human-14去除樣本中的高豐度蛋白，進行蛋白酶解和定量，依據說明書進行iTRAQ標記，采用高效液相色譜系統對iTRAQ標記后的4個生物學重復混合后的肽段樣品進行分離，并進行質譜分析。

1.2.3 ELISA法檢測ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平 ELISA試劑盒購自美國Cloud-Clone公司。按照說明書要求，稀釋血清樣本，繪制標準曲線，檢測ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1表達水平。

2 結果

2.1 CD4、CD8水平及CD4/CD8比較 FP組CD4水平低于JK組，CD4/CD8小于JK組，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組CD8水平比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。

表1 兩組CD4、CD8水平及CD4/CD8比較Table 1 Comparison of levels of CD4,CD8,and CD4/CD8 between the two groups

2.2 iTRAQ-MS技術鑒定ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平比較 兩組iTRAQ-MS技術鑒定ApoAⅠ水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；FP組iTRAQ-MS技術鑒定ApoAⅡ水平高于JK組，iTRAQ-MS技術鑒定ApoB、AZGP1水平低于JK組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表2 兩組iTRAQ-MS技術鑒定ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平比較Table 2 Comparison of levels of ApoAⅠ,ApoAⅡ,ApoB and AZGP1 detected by iTRAQ-MS technology between the two groups

2.3 ELISA法檢測ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平比較 兩組ELISA法檢測ApoAⅠ水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；FP組ELISA法檢測ApoAⅡ水平高于JK組，ELISA法檢測ApoB、AZGP1水平低于JK組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

3 討論

肺脾氣虛證作為HIV/AIDS常見的一種中醫證候，包括氣喘、易感冒、泄瀉、自汗、痰稀、胸悶、消瘦、惡風寒、心悸心慌、舌淡、脈虛弱等癥狀。中醫學認為，氣是從中國古代哲學中繼承而來，其是構成人體和維持人體生命活動的基本物質，氣的推動作用不足，則氣血生化乏源，出現消瘦、胸悶、心悸心慌等癥狀；氣的溫煦不足，則津液運行遲緩聚而生成痰飲，產熱少則惡風寒；氣的防御作用減退，患者易感冒；氣虛不能固攝體內的津液，則會出現自汗、泄瀉等癥狀。

表3 兩組ELISA法檢測ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoB、AZGP1水平比較Table 3 Comparison of levels of ApoAⅠ,ApoAⅡ,ApoB and AZGP1 detected by ELISA method between the two groups

本課題組最初進行的河南省HIV/AIDS中醫證候流行病調查顯示，肺脾氣虛證是HIV/AIDS常見的基本虛證證型[1]；通過對HIV/AIDS中醫病因、病理機制的研究發現，AIDS發病機制主要是艾毒傷元(將HIV稱為艾毒)，屬于中醫病因中的癘氣，艾毒侵入人體易傷肺、脾、腎等臟器，形成以虛證為主、虛實夾雜的復雜病理表現[9]；進一步對HIV/AIDS中醫證候進行客觀化、標準化研究[10-11]，通過對肺脾氣虛證的四診信息及證候指標，采用Logistic回歸、因子分析及結構方程模型進行定性定量分析，制定出HIV/AIDS肺脾氣虛證中醫診斷量表，并構建了AIDS中醫證候數據庫[12]。本研究采用iTRAQ-MS技術對HIV/AIDS中醫證候進行蛋白質組學研究，運用ELISA法進行了驗證，以期發現HIV/AIDS肺脾氣虛證的生物標志物，闡釋HIV/AIDS肺脾氣虛證的機制，為中醫證候量化提供依據。

Apo參與了脂蛋白的代謝過程，其在體內發生改變，就會影響到脂蛋白的生成、功能、代謝等，導致脂蛋白代謝紊亂，發生一系列的病理改變。ApoAⅠ、ApoAⅡ是高密度脂蛋白(HDL)的主要蛋白，而ApoB是構成低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白。吳劍鋒等[13]研究發現，ApoAⅠ對HDL生成的影響，可為防治動脈粥樣硬化提供新的思路和治療靶點。范玉蘭等[14]也認為，ApoAⅠ/ApoB可用來評估頸動脈斑塊的危險程度。趙長新等[15]對1 038例農村高血壓患者調查分析發現，患者血清中ApoB/ApoAⅠ升高與肥胖有關。蔣海霞[16]研究發現，在2型糖尿病患者中，ApoAⅠ、ApoB和脂蛋白的聯合檢測對患者早期診斷有意義。艾艷紅等[17]對126例缺血性腦梗死患者血清檢測分析發現，ApoB/ApoAⅠ較正常人升高，可作為實驗室診斷指標。梁晶晶等[18]研究發現，ApoAⅠ、ApoB在膝關節骨性關節炎患者血清中的表達水平降低。雷成多等[19]通過對120例慢性丙型肝炎患者血清中ApoB、ApoAⅠ表達水平分析發現，ApoB/ApoAⅠ與肝損傷程度有關，與肝纖維化分期呈負相關。黎健等[20]也發現，ApoAⅡ可以保護內皮細胞的損傷，預防動脈粥樣硬化。本研究結果顯示，兩組iTRAQ-MS技術鑒定、ELISA法檢測ApoAⅠ水平均無差異；FP組iTRAQ-MS技術鑒定、ELISA法檢測ApoAⅡ水平均高于JK組，iTRAQ-MS技術鑒定、ELISA法檢測ApoB水平均低于JK組，提示HIV/AIDS肺脾氣虛證患者存在脂代謝紊亂，血脂水平異常，可在下一步研究中檢測HDL、LDL、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)水平，探索HIV/AIDS肺脾氣虛證的作用機制，探討HIV/AIDS肺脾氣虛證患者與脂代謝紊亂相關疾病的關系及進一步發展趨勢。AZGP1是一種糖蛋白，是一種新的脂肪因子[21]，動物實驗研究發現，對高脂肪飲食造成的肥胖抗性大鼠血清檢測發現，AZGP1表達水平明顯增高；另有實驗也證實，如果敲除AZGP1基因，AZGP1表達水平減少，引起脂肪生成基因表達水平增加，導致脂質水平升高[22]；研究者在治療AIDS患者過程中也發現，脂質代謝障礙的AIDS患者常會出現胰島素抵抗和血脂異常引起的動脈粥樣硬化，血清AZGP1水平明顯降低，并且與HDL、膽固醇水平呈正相關[23]。大量文獻報道了AZGP1異常表達，尤其是表達下調與體內脂質代謝異常和腫瘤密切相關[24]。本研究結果顯示，FP組iTRAQ-MS技術鑒定、ELISA法檢測AZGP1水平均低于JK組，提示HIV/AIDS肺脾氣虛證患者血清中脂類物質代謝紊亂，可能引起脂質水平升高。

在現代醫學中，痰、濕多被認為是人體內脂類物質代謝障礙所導致的。而在中醫學中，痰濕多被認為與脾臟、肺臟有關。痰濕困阻，清陽不升，造成疲乏無力、納呆等癥狀。也有研究表明，AIDS疲勞患者血液中脂類物質表達異常[25]。肺脾氣虛證日久氣血生化乏源，正氣不足，衛外功能受損則抵抗力下降，容易遭受邪氣侵犯。本研究結果顯示，FP組CD4水平低于JK組，CD4/CD8小于JK組，提示患者免疫力降低，表現為一系列的機會感染；正虛氣血生化乏源，漸至氣血虧虛，因虛致瘀；脾不運化水濕，痰濕內生，痰瘀互結。

綜上所述，HIV/AIDS肺脾氣虛證患者血清中ApoAⅡ水平升高，ApoB、AZGP1水平降低，與脂質代謝有關。本研究樣本量偏小，在今后的研究中將擴大樣本量，并采用更多的方法從不同方面行進一步的研究，為中醫證候的標準化提供依據。

作者貢獻：張淼進行試驗設計與實施，撰寫論文、成文并對文章負責；張海燕、高亮進行試驗實施、資料收集；馬素娜進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Pathological Mechanism of Lung Spleen Qi Deficiency Syndrome in HIV/AIDS

ZHANGMiao,MASu-na,ZHANGHai-yan,GAOLiang.AIDSInstitute,He′nanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046,China

Correspondingauthor:MASu-na,AIDSInstitute,He′nanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046,China;E-mail:907702957@qq.com

Objective To explore the difference of expression levels of ApoAⅠ,ApoAⅡ,ApoB and AZGP1 among patients with lung spleen qi deficiency syndrome and HIV/AIDS,and provide the basis for research of TCM syndrome features of HIV/AIDS.Methods From December 2013 to June 2014,28 HIV/AIDS patients with lung spleen qi deficiency syndrome from a certain area of He′nan province were selected as HIV/AIDS with lung spleen qi deficiency syndrome group (FP group).In the same period,16 healthy people from the same region were selected as control group (JK group).Serum of objects was collected,and the levels of CD4,CD8and CD4/CD8were detected.The levels of ApoAⅠ,ApoAⅡ,ApoB,AZGP1 were identified by iTRAQ-MS technology,and detected by ELISA method.Results The level of CD4and CD4/CD8in FP group were significantly lower than those in JK group (P<0.05).There was no significant difference in CD8level between the two groups (P>0.05).There was no significant difference in ApoAⅠ level identified by iTRAQ-MS technology between the two groups (P>0.05).The ApoAⅡ level identified by iTRAQ-MS technology in FP group was higher than that in JK group (P<0.05).Levels of ApoB and AZGP1 identified by iTRAQ-MS technology in FP group were lower than those in JK group (P<0.05).There was no significant difference in ApoAⅠ level detected by ELISA method between the two groups (P>0.05).The ApoAⅡ level detected by ELISA method in FP group was higher than that in JK group (P<0.05).Levels of ApoB and AZGP1 detected by ELISA method in FP group were lower than those in JK group (P<0.05).Conclusion ApoAⅡ level increased,levels of ApoB and AZGP1 decreased in serum of HIV/AIDS patients with lung spleen qi deficiency syndrome,and this is related to lipid metabolism.

HIV/AIDS;Lung spleen qi deficiency syndrome;Apolipoprotein

傳染病國家科技重大專項“十二五”計劃(2012ZX100050001-005)；河南中醫學院2012年博士科研基金項目(BSJJ2012-12)

450046 河南省鄭州市，河南中醫藥大學艾滋病研究所

馬素娜，450046 河南省鄭州市，河南中醫藥大學艾滋病研究所；E-mail：907702957@qq.com

R 512.91

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.33.012

2016-03-10；

2016-09-08)