318例中國(guó)漢族非綜合征性耳聾患者基因突變譜分析①

王屹，陳蕾，劉志忠，張海燕，馬娟

318例中國(guó)漢族非綜合征性耳聾患者基因突變譜分析①

王屹1,2，陳蕾1,2，劉志忠1,2，張海燕3，馬娟3

目的應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)對(duì)先天性非綜合征性耳聾患者進(jìn)行耳聾基因篩查。方法采集2015年10月～2016年4月318份先天性非綜合征性耳聾患者抗凝靜脈全血，應(yīng)用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和MALDI-TOFMS的方法進(jìn)行中國(guó)人常見的四個(gè)耳聾基因GJB2、SLC26A4、GJB3、線粒體12Sr RNA共20個(gè)位點(diǎn)的突變檢測(cè)。結(jié)果共檢出GJB2基因突變111例(34.9%)，其中235delC的突變攜帶率最高(25.47%)；SLC26A4基因突變43例(13.5%)；GJB3基因突變3例(0.94%)；線粒體12Sr RNA基因突變12例(3.77%)。結(jié)論確定不同非綜合征性耳聾人群相關(guān)基因突變譜，對(duì)于建立先天性耳聾患者理想的基因篩查方法意義十分重要。

非綜合征性耳聾；基因突變；基質(zhì)輔助激光解析/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜

[本文著錄格式]王屹，陳蕾，劉志忠，等.318例中國(guó)漢族非綜合征性耳聾患者基因突變譜分析[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2016,22(12):1451-1454.

CITED AS:Wang Y,Chen L,Liu ZZ,et al.Mutation spectra of genes in 318 Chinese Han population w ith nonsyndrom ic hearing loss[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(12):1451-1454.

聽力受損是目前最常見的神經(jīng)感覺(jué)性障礙，世界范圍內(nèi)兒童發(fā)病率約為1‰[1]。耳聾是我國(guó)第一大殘疾，聽力殘疾者約2800萬(wàn)，占總殘疾人口的1/3。根據(jù)原衛(wèi)生部發(fā)布的《中國(guó)出生缺陷防治報(bào)告(2012)》[2]，我國(guó)每年新發(fā)先天性聽力障礙3.5萬(wàn)例，其中遺傳因素所致的耳聾約占60%，加上遲發(fā)型耳聾和藥物性耳聾患者，每年新增的聽力障礙兒童超過(guò)6萬(wàn)。遺傳因素所致的耳聾中，77%～99%是常染色體隱性遺傳，表現(xiàn)為典型的語(yǔ)前聾；大約10%～20%是常染色體顯性遺傳，其余病例與X-性連鎖和線粒體遺傳相關(guān)。

遺傳性耳聾又分為綜合性和非綜合征性耳聾(nonsyndrom ic hearing loss,NSHL)，以聽力受損為唯一癥狀的非綜合征性耳聾大約占70%。從上世紀(jì)90年代開始，耳聾相關(guān)基因研究日益增加。2014年非綜合征性耳聾定位已經(jīng)超過(guò)170個(gè)基因座，涉及90個(gè)基因，到2016年涉及的基因近110個(gè)[3-5]。部分基因異常所致耳聾并非先天性的，而是嬰兒出生之后逐步形成或者使用藥物不當(dāng)所致。因此，新生兒出生時(shí)單純進(jìn)行聽力篩查難以排除此類致聾因素，還需輔以基因檢測(cè)[6-8]。通過(guò)對(duì)基因的識(shí)別可以及早干預(yù)、預(yù)防先天性耳聾出生缺陷，控制藥物致聾風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)防或者延緩耳聾的發(fā)生發(fā)展。

目前的研究表明，與中國(guó)人遺傳性耳聾最為密切相關(guān)的耳聾基因?yàn)镚JB2、SLC26A4、GJB3、線粒體12Sr RNA。本研究收集318份山東臨沂和湖北宜昌的耳聾患者全血血樣，通過(guò)應(yīng)用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)結(jié)合飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)樣本GJB2、SLC26A4、GJB3、線粒體12Sr RNA四個(gè)基因20個(gè)常見突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2015年10月～2016年4月湖北宜昌特殊教育學(xué)校、山東臨沂特殊教育中心耳聾患者的全血血樣。

納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)其他遺傳性疾病耳聾；非綜合征性耳聾。

排除標(biāo)準(zhǔn)：外傷性耳聾、存在其他基因相關(guān)疾病及綜合性耳聾。

所有研究對(duì)象為漢族人，且均對(duì)本項(xiàng)研究簽署知情同意書。采集耳聾患者外周血2m l，乙二胺四乙酸(ethylene diam ine tetraacetic acid,EDTA)抗凝。

1.2 突變分析

應(yīng)用核酸提取試劑(上海百傲科技服份有限公司)進(jìn)行全血樣本DNA的提取。提取的DNA樣本保存于-20℃。應(yīng)用耳聾相關(guān)基因檢測(cè)試劑盒(微陣列芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜法)(北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司)。DNA樣本進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：95℃30 s，56℃30s；72℃60 s，45個(gè)循環(huán)；最后72℃300 s。PCR擴(kuò)增后，加入蝦堿酶(shrimp alkaline phosphatase, SAP)消化，延伸；將裝有延伸混合物、SAP酶消化產(chǎn)物的PCR管/孔置于PCR擴(kuò)增儀內(nèi)。用樹酯進(jìn)行純化，將純化產(chǎn)物進(jìn)行靶板點(diǎn)樣，并應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司)進(jìn)行樣本的相關(guān)基因突變分析。

2 結(jié)果

共收集先天性非綜合征性耳聾患者318例，其中男性173例，女性145例；0～13歲145例，14～25歲173例，平均(14±4.8)歲；山東臨沂市158例，湖北宜昌市160例。

本研究共檢測(cè)四個(gè)基因包括20個(gè)位點(diǎn)的突變情況。318例耳聾患者中，GJB2基因突變的比例最高，有111例(34.9%)；SLC26A4基因突變次之，有43例(13.5%)；GJB3基因突變的有3例(0.94%)；線粒體12Sr RNA突變的有12例(3.77%)。見表1。

表1 四個(gè)耳聾基因突變的檢測(cè)結(jié)果〔n(%)〕

GJB2基因中，235delC位點(diǎn)雜合突變43例(13.52%)，純和突變38例(11.95%)；其次為299_ 300delAT，雜合突變24例(7.55%)，純和突變1例(0.31%)；176_191del16位點(diǎn)的雜合突變?yōu)?例，未檢測(cè)到純和突變。其余兩個(gè)位點(diǎn)167delT、35delG未檢測(cè)到突變。

SLC26A4基因中，突變水平最高的是IVS7-2，共29例(9.12%)，其中雜合突變?yōu)?8例(5.66%)，純和突變?yōu)?1例(3.46%)；其次為2168A＞G位點(diǎn)，檢測(cè)到5例(1.57%)雜合突變，其中2027T＞A、281C＞T兩個(gè)位點(diǎn)在318例患者中未檢測(cè)到突變。

GJB3基因中，538C＞T和547G＞A的突變比例均較低，分別檢測(cè)到1例(0.31%)和2例(0.63%)。

線粒體12Sr RNA基因中，1555A＞G的同質(zhì)突變比例最高，共9例(2.83%)，檢測(cè)到1例異質(zhì)突變(0.31%)。見表2。

有23例患者同時(shí)檢測(cè)到GJB2基因的兩個(gè)位點(diǎn)突變，有5例患者同時(shí)有SLC26A4基因的兩個(gè)突變位點(diǎn)，2例患者同時(shí)出現(xiàn)GJB2基因和SLC26A4的突變位點(diǎn)。

表2 四個(gè)耳聾基20個(gè)突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果〔n(%)〕

3 討論

分子生物學(xué)方法是目前遺傳性耳聾診斷的主要手段，目前國(guó)內(nèi)外建立了很多耳聾基因的篩查方法，但無(wú)論是被人們認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)的Sanger測(cè)序，還是其他如多限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)基因芯片技術(shù)、高效液相色譜技術(shù)等技術(shù)，都存在檢測(cè)效率低、成本高的問(wèn)題。傳統(tǒng)序列方法對(duì)于不明確突變熱點(diǎn)的疾病篩查往往無(wú)效。飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)以其高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、多重基因檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)得到全球醫(yī)學(xué)界的認(rèn)可，成為分子診斷行業(yè)繼PCR技術(shù)、芯片技術(shù)、測(cè)序技術(shù)之后最新得到美國(guó)食品和藥物管理局認(rèn)可的基因診斷平臺(tái)。本研究應(yīng)用多重PCR技術(shù)結(jié)合MALDI-TOFMS技術(shù)檢測(cè)國(guó)人常見的四種基因20個(gè)位點(diǎn)的突變情況。

GJB2是1997年報(bào)道的第一個(gè)導(dǎo)致常染色體隱性遺傳耳聾的基因[9]，編碼連接蛋白26(connexin 26, Cx26)，是耳蝸縫隙連接的重要蛋白。該基因突變所致的耳聾臨床表現(xiàn)為先天性重度以上感音神經(jīng)性耳聾，治療以人工耳蝸移植效果較好。耳聾基因GJB2的突變率在高加索人種常染色體隱性遺傳非綜合征性耳聾中大約占50%，世界其他地區(qū)明顯低于該水平[10-11]。其中C.35delG突變?cè)诖蟛糠指呒铀魅朔N的攜帶頻率最高，大約占GJB2基因突變的70%[12]。

中國(guó)人GJB2基因突變常見突變位點(diǎn)為235delC、299-300delAT、176_191del16、35delG、167delT。本研究對(duì)318例先天性非綜合征性耳聾患者血液樣本進(jìn)行分析，GJB2的突變攜帶率為34.9%，其中235delC的突變攜帶率占GJB2基因突變的76.57%。235delC突變是包括中國(guó)漢族人在內(nèi)的亞洲人群最常見的突變類型[13-14]。Meng等應(yīng)用目標(biāo)區(qū)域測(cè)序技術(shù)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷遺傳性耳聾1例，經(jīng)臨床分子遺傳學(xué)確診為GJB2基因復(fù)合雜合突變致聾[15]。本研究中有24例(7.55%)發(fā)生GJB2基因復(fù)合雜合突變。

SLC26A4基因又稱Pendrin基因，編碼蛋白質(zhì)Pendrin(陰離子氯/碘)轉(zhuǎn)運(yùn)跨膜蛋白。該基因突變引起的耳聾已明確為常染色體隱性遺傳，對(duì)于耳聾人群中非綜合征性前庭導(dǎo)水管擴(kuò)張(enlarged vestibular aqueduct,EVA)具有顯著的預(yù)測(cè)意義[16]。常見突變位點(diǎn)為281C＞T、589G＞A、IVS7-2A＞G、1174A＞T、1226G＞A、1229C＞T、IVS15-5G＞A、1975G＞C、2027T＞A、2162C＞T、2168A＞G。

大前庭導(dǎo)水管(enlarged vestibular aqueduct,EVA)綜合征在亞洲人群的發(fā)病與SLC26A4基因突變密切相關(guān)，在亞洲人群尤其是中國(guó)人中風(fēng)險(xiǎn)增加[17]。其中最常見的突變位點(diǎn)在韓國(guó)和日本為p.H723R，而在中國(guó)大陸和臺(tái)灣則為IVS7-2A＞G[18]。本研究中SLC26A4突變的比例為13.4%，其中IVS7-2A＞G位點(diǎn)的總突變率為9.12%，純合突變占SLC26A4突變的37.93%，雜合突變占62.07%，復(fù)合雜合突變占24.13%。這與2004年報(bào)道的284例中國(guó)人SLC26A4突變的比例為18.66%基本接近，高于歐洲人群(3.5%)。攜帶SLC26A4基因2條等位基因突變的患者表現(xiàn)為前庭水管擴(kuò)大，攜帶SLC26A4基因單條等位基因突變的患者30%會(huì)表現(xiàn)為前庭水管擴(kuò)大；凡是引起顱內(nèi)與內(nèi)耳的通道異常擴(kuò)大、顱腔與內(nèi)耳的通道異常擴(kuò)大，以及引起顱內(nèi)壓變化的因素，如輕度的頭部碰撞、感冒等，都能引起EVA綜合征患兒聽力下降。

GJB3基因編碼縫隙連接蛋白31(Cx31)，其錯(cuò)義突變538C＞T被認(rèn)為與語(yǔ)后高頻聽力下降有關(guān)[19]，常見突變位點(diǎn)：538C＞T、547G＞A。GJB3基因突變?cè)谥袊?guó)人群中攜帶率低(＜3%)。本研究中，GJB3基因突變率為0.94%，均為雜合突變。

線粒體12Sr RNA的突變通過(guò)改變線粒體DNA的空間結(jié)構(gòu)，形成新的與氨基糖甙類抗生素結(jié)合位點(diǎn)而導(dǎo)致對(duì)此類藥物敏感而致聾。可通過(guò)母親傳給后代，后代中女性可將突變基因繼續(xù)傳給下一代。主要突變位點(diǎn)為1555A＞G[20]、1494C＞T[21]。本研究中，線粒體12Sr RNA基因突變率為3.77%，多為同質(zhì)突變，僅有1例異質(zhì)突變。

本研究應(yīng)用四個(gè)基因20個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)體系，發(fā)現(xiàn)在318例患者中，約50%患者攜帶耳聾致病基因。隨著對(duì)耳聾基因的深入研究，將會(huì)在越來(lái)越多的先天性耳聾患者中發(fā)現(xiàn)遺傳背景，從而更好地在其生活、婚育等方面給予指導(dǎo)。高通量的檢測(cè)技術(shù)也將為我國(guó)大群體的耳聾患者提供更多有價(jià)值的指導(dǎo)。

在318例中國(guó)漢族人中，GJB2基因突變水平最高，達(dá)34.9%，235delC的突變攜帶率最高(25.47%)，與國(guó)內(nèi)報(bào)道相關(guān)地區(qū)中國(guó)人的突變譜[22-25]基本一致。不同非綜合征性耳聾人群中確定相關(guān)基因突變譜對(duì)于為先天性耳聾患者建立理想的基因篩查方法十分重要。

志謝

感謝北京益新博創(chuàng)生物科技公司的技術(shù)支持，以及中國(guó)殘疾人藝術(shù)團(tuán)、臨沂市特殊教育中心、宜昌市特殊教育中心的社會(huì)支持。

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M utation Spectra of Genes in 318 Chinese Han Population w ith Nonsyndrom ic Hearing Loss

WANG Yi1,2,CHEN Lei1,2,LIU Zhi-zhong1,2,ZHANG Hai-yan3,MAJuan3
1.Beijing Bo'aiHospital,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China;2.CapitalMedicalUniversity Schoolof Rehabilitation Medicine,Beijing 100068,China;3.Bioyong Technologies Inc.,Beijing 100086,China

ObjectiveTo define themutation spectra of deafness gene in 318 Chinese Han population w ith nonsyndromic hearing loss (NSHL).MethodsFrom October,2015 to April,2016,anticoagulant venousw hole blood of 318 patients w ith NSHL w ere collected.The genes including GJB2,SLC26A4,GJB3 and 12Sr RNA were detected w ith polymerase chain reaction(PCR)and Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-FightMass Spectrometry(MALDI-TOFMS).ResultsAmong these patient,111 cases(34.9%)had GJB2mutations,in which themutation carrying rate of 235delC w as the highest(25.47%),43 cases(13.5%)had SLC26A4mutations,3 cases(0.94%) had GJB3mutations,and 12 cases(3.77%)hadmitochondria 12Sr RNAmutations.ConclusionDefinition ofmutation spectrum among differentpopulationswith NSHL is important for developmentof optimalgenetic screening services for congenitalhearing impairment.

nonsyndrom ic hearing loss;genemutation;M atrix Assisted LaserDesorption/Ionization Time-Of-FightMass Spectrometry

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.12.019

R246.81

A

1006-9771(2016)12-1451-04

2016-08-02

2016-10-02)

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃)項(xiàng)目(No.2014AA020901)。

1.中國(guó)康復(fù)研究中心北京博愛(ài)醫(yī)院，北京市100068；2.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068；3.北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司，北京市100086。作者簡(jiǎn)介：王屹(1980-)，女，漢族，山西大同市人，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向：耳聾基因檢測(cè)在疾病防控中的應(yīng)用研究。通訊作者：劉志忠，男，博士，主任技師。E-mail:lzzlzb@126.com。