一株高效石油降解菌的篩選及其降解條件優(yōu)化

摘要：從中原油田石油污染土壤中分離到一株新的石油降解菌HNAU-1，經(jīng)16S rDNA測序鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。該菌可以以石油為惟一碳源進行生長，10 d的降解率可達50.7%。單因素試驗表明添加其他碳源（葡萄糖、淀粉和蔗糖）均可抑制該菌對石油的降解；以尿素為氮源，35 ℃（25～35 ℃范圍內(nèi)），pH 7.5，鹽度為0.5%，十二烷基硫酸鈉為表面活性劑均有利于菌株對石油的降解。

關(guān)鍵詞：微生物；降解；石油；優(yōu)化；篩選

中圖分類號：X172 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4141-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.017

石油是原油和石油制品的總稱，是一種由多種烴類（正烷烴、支鏈烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴、多環(huán)芳烴）及少量非烴化合物和有機金屬組成的復(fù)雜混合物。據(jù)統(tǒng)計，中國每年約有60萬t的石油及其制品通過各種途徑進入環(huán)境，污染土壤、地下水、河流、海洋[1]。石油烴在環(huán)境中的持久性很強，危害性也較大，不僅具有強烈的致癌、致畸和致突變毒性[2-5]，還能通過食物鏈在動植物體內(nèi)逐級富集和放大，進而對人體健康造成嚴(yán)重的威脅[6-8]。石油污染也因此引起人們的高度關(guān)注。

對于環(huán)境中的石油污染，目前有物理、化學(xué)和生物方法將其去除[9]。物理和化學(xué)方法雖然見效快，但是成本較高，而且容易造成二次污染，因此限制了其在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用。生物方法最常見的是采用微生物對石油進行降解，該方法成本較低，而且不會造成二次污染，有望成為具有廣闊應(yīng)用前景的修復(fù)方法[10]。但是在中國生物方法并未得到廣泛的應(yīng)用，其原因是降解菌活性不高。本研究從中原油田土壤中篩選得到1株高效石油降解菌，并采用單因素試驗對其降解石油的條件進行了優(yōu)化，有望用于未來石油污染修復(fù)中。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

石油污染土壤采自中原油田，用于分離石油降解菌。

液體培養(yǎng)基成分為：（NH4）2SO4 0.5 g、NaNO3 0.5 g、MgS04·7H2O 0.2 g、KH2PO4 1.0 g、NaH2PO4·H2O 1.0 g、CaCl2 H2O 0.02 g，用去離子水配制成1 L液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加18 g/L瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min即可。

無機鹽培養(yǎng)基：葡萄糖5 g、NH4NO3 2 g、K2HPO4 0.5 g、KH2PO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、無水CaCl2 0.02 g、NaCl 5 g、FeCl3·6H2O 0.02 g，用去離子水配制成l L液體培養(yǎng)基，105 ℃滅菌20 min。

1.2 菌株篩選

取1 g石油污染土壤分別添加到100 mL液體培養(yǎng)基中，避光培養(yǎng)（28 ℃，180 r/min）7 d后，轉(zhuǎn)接于新的液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復(fù)5次。取0.1 mL培養(yǎng)液均勻涂布在含固體培養(yǎng)基的平板上，30 ℃避光培養(yǎng)，每天觀察菌落生長情況。待菌落長出，挑選形態(tài)不同的菌落轉(zhuǎn)接到新的含固體培養(yǎng)基的平板上，如此反復(fù)數(shù)次，直到形成形態(tài)單一的菌落，即為純化的菌株，4 ℃保存，備用[11]。

1.3 菌株鑒定

將純化后的菌株接種至無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d（28 ℃），觀察形態(tài)特征，采用DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）提取菌株總DNA；采用引物27F及1492R進行石油降解菌的16S rDNA片段的PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性8 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物由北京美億美生物技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果導(dǎo)入CenBank數(shù)據(jù)庫中，通過Blast進行同源性比較。

1.4 石油降解率試驗

取1 mL菌液（OD600 nm=0.8）接種至100 mL液體培養(yǎng)基中，建立降解體系并進行培養(yǎng)（30 ℃、180 r/min），10 d后分析降解體系中石油含量，以不接菌的處理作為對照。

為研究不同反應(yīng)條件對菌株降解石油的影響，進行以下5組單因素試驗：

1）不同石油濃度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%。

2）不同溫度：25、30和35 ℃。

3）不同pH：pH 6.5、7.5和8.5。

4）不同鹽度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%。

5）不同表面活性劑：0.5%曲拉通X-100（TX-100）、0.5%十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.5%吐溫-80。

1.5 石油含量分析

采用重量法分析石油含量[12]。具體方法：在石油降解體系中加入20 mL石油醚，萃取培養(yǎng)基中的石油，重復(fù)操作3次；合并上層液，轉(zhuǎn)至分液漏斗，劇烈振蕩5 min，靜置，待分層后進行分離。用石油醚洗滌三角瓶2～3次，再合并上層液。將其在58 ℃條件下蒸發(fā)，待石油醚完全蒸發(fā)，殘留石油組分置于干燥器中冷卻至恒重，稱量。計算石油的降解率公式為：

降解率=（m1-m2）/m×100%

式中，m為培養(yǎng)體系中初始石油質(zhì)量；m1為對照組的殘油質(zhì)量；m2為樣品的殘油質(zhì)量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

對分離到的石油降解菌HNAU-1進行形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)菌株邊緣整齊，表面濕潤，紅棕色，半透明，細胞大小為（0.8～1.0） μm×（1.5～2.5） μm，有鞭毛，呈桿狀。提取該菌DNA，經(jīng)PCR擴增、16S rDNA測序，然后通過Blast檢索并與GenBank中序列進行比對，發(fā)現(xiàn)該菌基因序列與Pseudomonas sp.相似度達97%（圖1），表明該菌屬于假單胞菌屬。

2.2 菌株的生長及對石油的降解特性

以石油為惟一碳源研究菌株HNAU-1的生長曲線和石油降解特性（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)OD600 nm在培養(yǎng)期內(nèi)呈逐步上升趨勢，在第10天達到最大值（1.23）。石油的降解率在培養(yǎng)期內(nèi)也呈逐步上升趨勢，在第10天達到最大值（50.7%），較芽孢桿菌屬H1對石油的降解率高（35%）[13]，由此可見，該菌株能以石油為惟一碳源進行生長，并具有較高的石油降解能力。

2.3 不同碳源對菌株降解石油的影響

通過比較不同碳源對菌株降解石油的影響（圖3）發(fā)現(xiàn)，不加外源碳源菌株對石油的降解率為48.7%，而在培養(yǎng)基中添加葡萄糖、蔗糖和淀粉時，均不同程度抑制了菌株對石油的降解。其中，葡萄糖的抑制作用最大，降解率僅為9.7%；其次為蔗糖和淀粉，降解率為24.7%和36.5%，這可能與不同碳源的生物可利用性有關(guān)，石油屬疏水性物質(zhì)，不易被微生物利用，而3種外源碳源均較石油容易被微生物利用，當(dāng)這些碳源耗盡時，石油才可被進一步利用，從而被降解。3種外加碳源之中，葡萄糖最容易被利用，因此對石油的降解抑制作用最大。目前碳源對石油降解影響的資料較為少見，該現(xiàn)象提示當(dāng)采用微生物降解石油時，應(yīng)避免存在其他容易利用的碳源，否則會降低菌株對石油的降解率。

2.4 不同氮源對菌株降解石油的影響

通過比較不同氮源對菌株降解石油的影響（圖4），發(fā)現(xiàn)尿素作為氮源時，菌株對石油的降解率最高，達到54.9%，其次為硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨和蛋白胨，降解率分別為31.4%、30.7%、24.7%和18.0%。王鑫等[14]曾研究了不同氮源對微生物降解石油能力的影響，發(fā)現(xiàn)菌株R4和D3的最優(yōu)氮源為NaNO3，T4的最優(yōu)氮源為NH4NO3，可見對于不同菌株，最佳的氮源是不同的。陳梅梅等[15]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌的最佳氮源為尿素，與本研究結(jié)果相似。

2.5 不同鹽度對菌株降解石油的影響

通過比較不同鹽度對菌株降解石油的影響（圖5），發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)基中鹽度的增加，菌株對石油的降解率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)培養(yǎng)基鹽度為0時，菌株對石油的降解率最低，僅為35.5%，當(dāng)鹽度增加到0.5%時，菌株對石油的降解率達到最大值（77.4%），其后隨著鹽度的增加，菌株對石油的降解率稍有降低，維持在62.5%～67.2%之間。表明適當(dāng)?shù)柠}度有利于菌株對石油的降解，以0.5%為宜。這可能與微生物的長期生存環(huán)境有關(guān)，該菌株從中原油田附近土壤分離得到，該地區(qū)不僅受到石油污染，同時土壤中還有較高的鹽分，微生物可能已經(jīng)適應(yīng)了高鹽的生存環(huán)境。多數(shù)石油降解菌都具有耐鹽能力，例如假單胞菌屬DH-5、克雷伯氏菌屬DH-9和芽孢桿菌屬X-1均在2%的鹽度條件下對石油的降解率最高[16，17]；在石油污染土壤修復(fù)過程中，含鹽量也極大地影響著微生物修復(fù)效率，土壤中含鹽量為0.01%比含鹽量0.22%的石油的降解率增加了1.22倍[18]。菌株HNAU-1在0.5%～2.0%的含鹽范圍內(nèi)石油降解率均可達60%以上，因此尤其適合高鹽石油污染土壤的修復(fù)。

2.6 不同溫度對菌株降解石油的影響

通過比較不同溫度對菌株降解石油的影響（圖6），發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高（25～35 ℃），菌株對石油的降解率呈逐漸增加的趨勢，其中，以溫度達到35 ℃時降解率最高，為55.2%，而溫度為25 ℃時石油降解率最低，只有17.0%，表明該菌株最適溫度為35 ℃，而當(dāng)溫度過低，降解率會急劇降低，因此該菌株不適合低溫環(huán)境下對石油的修復(fù)。這與辛蘊甜等[12]的研究結(jié)果相似。

2.7 不同pH對菌株降解石油的影響

通過比較不同pH對菌株降解石油的影響（圖7），發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)（pH 6.5～8.5，為北方土壤常見的pH），隨著pH的升高，降解率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。當(dāng)pH 6.5時，降解率只有10.8%，當(dāng)pH 7.5時，降解率最大，達到50.3%，之后當(dāng)pH繼續(xù)升高，降解率開始下降，當(dāng)pH 8.5時，降解率僅為37.6%。表明該菌株對pH較為敏感，過高或過低的pH均會抑制其對石油的降解，最適pH為7.5。而辛蘊甜等[12]分離到的芽孢桿菌降解石油最適pH為7.0，表明不同菌株最適的pH不同，應(yīng)與菌株所處的環(huán)境有關(guān)。

2.8 不同表面活性劑對菌株降解石油的影響

通過比較發(fā)現(xiàn)不同表面活性劑對菌株降解石油的影響不同（圖8）。不添加表面活性劑菌株對石油的降解率為34.6%，添加TX-100（曲拉通X-100）和SDS（十二烷基硫酸鈉）均顯著提高了菌株對石油的降解率，分別達到63.6%和67.3%，而添加Tween-80顯著抑制了菌株對石油的降解，降解率僅為16.8%。添加表面活性劑是改進菌株對疏水性底物利用的重要措施，張麗芳等[19]研究了4種表面活性劑對微生物降解石油的影響，發(fā)現(xiàn)較低濃度的表面活性劑促進石油降解，而當(dāng)濃度過高時抑制石油降解，可能與表面活性劑本身的毒性有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)的Tween-80抑制了石油的降解，可能是由于菌株對Tween-80的耐受性低造成的。

3 小結(jié)

從中原油田石油污染土壤中分離到一株石油降解菌HNAU-1，經(jīng)16S rDNA測序鑒定為假單胞菌屬，該菌可以以惟一碳源代謝石油，外加葡萄糖、淀粉和蔗糖均能抑制該菌對石油的降解，采用該菌降解石油，其最佳降解條件為：以尿素為氮源，35 ℃（25～35 ℃范圍內(nèi)），pH 7.5，鹽度為0.5%，SDS為表面活性劑，這些結(jié)果為進一步采用該菌用于石油土壤修復(fù)奠定了基礎(chǔ)。

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