褐飛虱R2D2基因的克隆及表達(dá)分析

摘要：R2D2蛋白廣泛分布于各種生物體中，R2D2是siRNA介導(dǎo)的RNA干擾途徑中的關(guān)鍵組分。R2D2含有一個串聯(lián)的dsRNA結(jié)合功能域，與Dcr-2在體內(nèi)形成雜合二聚體，在siRNA裝載入RISC時發(fā)揮作用。本研究克隆了褐飛虱（Nilaparvata lugens St？覽l）R2D2基因（NLR2D2），結(jié)果表明，NLR2D2基因全長 1 673 bp，含有一個長1 005 bp的開放閱讀框，編碼335個氨基酸。NLR2D2蛋白與螞蟻親緣關(guān)系最近。利用qRT-PCR檢測NLR2D2基因在褐飛虱不同發(fā)育階段的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NLR2D2轉(zhuǎn)錄本在褐飛虱的所有發(fā)育階段都有表達(dá)，在1齡若蟲中表達(dá)量最低，隨著生長發(fā)育表達(dá)量逐漸升高。NLR2D2基因的序列特征和表達(dá)譜非常保守，為其功能的分析提供了信息。

關(guān)鍵詞：褐飛虱（Nilaparvata lugens St？覽l）；R2D2基因；克隆；表達(dá)

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）16-4294-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.16.057

從原蟲、真菌到植物，從無脊椎動物到脊椎動物，RNA干擾（RNA Interference，RNAi）廣泛存在于生物界中。RNA沉默依賴于21～30個核苷酸長度的小RNA分子，分為3種類型：小干擾RNA（Small interfering RNAs，siRNA）、微小RNA（MicroRNAs，miRNA）及Piwi相關(guān)的干擾RNA（Piwi-associated interfering RNAs，piRNAs）。Dicer-2（Dcr-2）、Argonaute-2（AGO2）和雙鏈RNA結(jié)合蛋白R2D2是siRNA介導(dǎo)的RNA干擾途徑中的3個關(guān)鍵組分。Dicer-2/R2D2復(fù)合物不僅產(chǎn)生siRNA，還能結(jié)合siRNA（依賴于R2D2的dsRNA結(jié)合區(qū)域），并促進(jìn)siRNA與siRISC的結(jié)合。在這個過程中R2D2可視為連接RNAi起始階段和效應(yīng)階段的橋梁。Dicer-2、R2D2除了作用于siRNA的產(chǎn)生外，還作用于siRNA的解旋，解旋的siRNA則可作用于啟動siRISC[1]。研究發(fā)現(xiàn)，果蠅敲除R2D2基因后，F(xiàn)HV的滴度顯著上升[2]，對果蠅DXV的感受性也極顯著提高（P<0.01）[3]。

褐飛虱（Nilaparvata lugens St？覽l）屬同翅目飛虱科昆蟲，又稱褐稻虱。褐飛虱是水稻主要害蟲之一，在中國長江流域和華南及西南廣大稻區(qū)發(fā)生頻繁、危害嚴(yán)重[4]。本研究從褐飛虱體內(nèi)分離得到R2D2基因，分析了R2D2基因的全長、結(jié)構(gòu)，并對其在發(fā)育過程中的表達(dá)進(jìn)行分析，以期為研究其進(jìn)化提供新的資料，為研究褐飛虱R2D2基因的功能和在RNAi中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 褐飛虱品種（生物型Ⅱ）為武漢大學(xué)收藏，飼養(yǎng)在感蟲水稻品種臺中1號（TN1）植株上，環(huán)境條件為（25±2） ℃，80%的相對濕度，光照培養(yǎng)16 h/d，黑暗培養(yǎng)8 h/d。

1.1.2 試劑 試驗(yàn)所用大腸桿菌E. coli DH5α、Ex Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD18-T克隆載體、5′-Full RACE和3′-Full RACE試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。引物合成及序列測定由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 使用總RNA提取試劑盒RNAiso Plus提取褐飛虱發(fā)育時期的總RNA，將溶于無核酸酶水中的RNA置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 cDNA克隆 利用Apis mellifera的RLC蛋白（RISC-loading complex subunit tarbp2-like）（GenBank登錄號：552226）在褐飛虱的ESTs數(shù)據(jù)庫（http：//bphest.dna.affrc.go.jp/）中進(jìn)行TBLASTN查詢，找到褐飛虱的EST片段（GenBank登錄號：NLHT2093）。以該EST序列為模板設(shè)計(jì)RACE引物，以提取的總RNA為模板，使用RACE試劑盒分別合成5′和3′RACE cDNA。以合成的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行Outer PCR反應(yīng)和Inner PCR反應(yīng)，反應(yīng)引物見表1。Outer PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，20個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。Inner PCR反應(yīng)程序與以上程序相同，只是改為30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物利用寶生物工程（大連）有限公司試劑盒回收，與pMD18-T載體連接，陽性克隆送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測R2D2基因轉(zhuǎn)錄差異 取-80 ℃保存不同生長發(fā)育時期褐飛虱總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得褐飛虱的cDNA。在Roteogene 6000TM定量PCR儀（Corbett research）上進(jìn)行10 μL體系的PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min，以30～40個循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增（94 ℃變性20 s， 55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s），每個樣品3個重復(fù)，取平均值。以褐飛虱Actin作為參照基因，采用2-ΔΔCt方法[5]比較不同樣品基因表達(dá)水平。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 對5’ RACE序列和3’ RACE序列測序后拼接獲得cDNA全長序列。用ExPASy Translate tool軟件（http：//web.expasy.org/translate/）進(jìn)行翻譯得到相應(yīng)cDNA編碼框的預(yù)測，再利用下列在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的功能域及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測：用Clustalw（http：//www.genome.jp/tools/clustalw/）進(jìn)行同源序列比對；用MEGA4.0軟件進(jìn)行進(jìn)化樹的繪制；用ExPASy Compute pI/Mw tool（http：//web.expasy.org/compute_pi/）進(jìn)行分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分析；用http：//npsa-pbil.ibcp.fr/進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐飛虱R2D2基因的克隆

以褐飛虱EST序列為模板設(shè)計(jì)RACE引物，克隆得到NlRLC基因的5’cDNA片段和3’cDNA片段（圖1），5’cDNA序列長度約為693 bp，3’cDNA序列長度約為679 bp。

2.2 R2D2蛋白質(zhì)分析鑒定

全長序列經(jīng)過測序拼接后，全長為1 673 bp （圖2），含有一個編碼335個氨基酸的開放閱讀框（Open reading frame，ORF），預(yù)測分子質(zhì)量為37.4 ku，等電點(diǎn)為5.46。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，R2D2蛋白質(zhì)α螺旋占36.72%，延伸鏈占23.28%，隨機(jī)卷曲占40.00%（圖3）。

利用NCBI Conserved Domains Server分析表明，該開放閱讀框包含2個DSRM（Double-stranded RNA binding motif）功能域（圖4）。第一個有66氨基酸，并定位于第5至70氨基酸上；第二個有66氨基酸，并定位于第106至171氨基酸上。同時還含有多個rnc（ribonuclease Ⅲ）結(jié)合位點(diǎn)。

2.3 R2D2分子進(jìn)化分析

用NLR2D2編碼的氨基酸序列與蜜蜂A.mellifera（XP_001121349），螞蟻A.echinatior（EGI 67607），熊蜂王B.terrestris（XP_003395928），雄蜂B.impatiens（XP_003485505），金小蜂N.vitripennis（XP_001601132），囊舌蟲S.kowalevskii（XP_002739212），非洲爪蟾X.laevis（NP_001085574），安樂蜥A.carolinensis（XP_ 003216784），熱帶爪蟾X.tropicalis（NP_001025646）中的R2D2進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，R2D2與螞蟻、蜜蜂和熊蜂王中的R2D2聚類在一起，親緣關(guān)系較近，而與其他昆蟲的R2D2亞族成員親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)（圖5）。

2.4 褐飛虱R2D2基因不同生長發(fā)育時期的表達(dá)分析

為了解R2D2基因在褐飛虱不同生長發(fā)育階段蟲體中轉(zhuǎn)錄情況，分別提取1齡至5齡若蟲和雌雄成蟲蟲體的總RNA，利用實(shí)時熒光定量PCR法檢測該基因在褐飛虱不同發(fā)育階段蟲體中的表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著蟲體的長大，R2D2基因表達(dá)量逐漸增強(qiáng)，同時在雄成蟲的表達(dá)量較高（圖6）。

3 小結(jié)與討論

本研究克隆得到NLR2D2基因的全長，并且將氨基酸序列與其他昆蟲的R2D2進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)其與螞蟻的R2D2蛋白在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近。對褐飛虱R2D2蛋白序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)α螺旋占36.72%，延伸鏈占23.28%，隨機(jī)卷曲占40.00%。同時鑒定了NLR2D2基因在褐飛虱不同生長發(fā)育階段蟲體的轉(zhuǎn)錄情況，該基因在雄性成蟲的表達(dá)量較高。因此，褐飛虱NLR2D2基因的表達(dá)特征表明，利用農(nóng)藥防治褐飛虱的最佳時期是早期。這些結(jié)果有利于開發(fā)一些以NLR2D2基因?yàn)榘袠?biāo)的安全有效的殺蟲劑，同時可以利用RNA干擾的方法來抑制R2D2蛋白的表達(dá)，達(dá)到控制害蟲的目的。

參考文獻(xiàn)：

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