一氧化氮在植物響應重金屬脅迫中的作用

摘要：一氧化氮（Nitric oxide，NO）是一種具有擴散性的氣體分子，在哺乳動物中被鑒定為血管內皮細胞舒張因子，是一種有效的內源性血管舒張藥。植物也具有合成和釋放NO的能力，NO在植物中參與多種生理過程和脅迫響應。因此，NO被認為是植物及動物體內重要的氣體信號分子。近年來，由于各種人類活動的影響導致重金屬對農業生態環境造成了越來越嚴重的污染，威脅農作物生產與食品安全。盡管重金屬影響植物生長發育的機制并不完全清楚，但越來越多的證據顯示NO是植物體內響應重金屬脅迫的重要成分之一。就目前重金屬脅迫對植物內源NO的代謝以及外源NO對植物重金屬毒害的影響的研究進展進行了綜述。

關鍵詞：重金屬；一氧化氮；脅迫機制；植物

中圖分類號：S311；X71 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）13-3269-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.002

近年來，隨著工業化、城鎮化的快速發展，重金屬污染問題日益突出。根據國土資源部的調查結果，中國受重金屬污染的耕地已達2×107 hm2，受重金屬污染的糧食每年多達1 200萬t，部分受污染的糧食流入市場，嚴重影響農產品質量安全。因為重金屬不能像有機污染物一樣被微生物降解或轉化，土壤一旦被重金屬污染，則往往很難被修復。土壤中重金屬通過食物鏈的生物富集作用嚴重威脅人類的身體健康[1]。盡管重金屬對植物毒害的機制并不完全清楚，但越來越多的證據表明氧化脅迫損傷是植物重金屬毒害的重要表型之一[2]。已有很多研究證明重金屬可以通過改變植物體內抗氧化酶的活性或含量來導致氧化脅迫的產生[1]。在大約40種金屬和重金屬元素中，可以分為非氧化還原活性元素（如鋅、鎘等）和氧化還原活性元素（如鐵，銅等）。具有氧化還原活性的金屬元素在細胞內能促進芬頓反應（Fenton reaction），導致活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）的快速產生，從而造成細胞膜的損傷。非氧化還原活性元素雖然不能通過單電子反應直接產生自由基，但是能通過擾亂植物體內ROS產生與清除之間的平衡而間接觸發氧化脅迫。因此，幾乎所有重金屬元素都能誘導植物體內ROS的產生。另外，一些重金屬元素通過與蛋白質中巰基，組氨酰和羧基的親和性能直接結合到蛋白的結構性位點、催化位點或轉運位點，從而替代必需金屬元素與蛋白質特異性位點結合，導致蛋白質的功能失活。例如，在植物光系統Ⅱ（Photosystem II，PSII）反應中心，鎘離子（Cd2+）能取代鈣離子（Ca2+），從而抑制PSII的光反應活性[3]。

在重金屬對植物的影響中，植物體內ROS的累積已經被證明。大部分ROS以羥基自由基（·OH）的形式存在，羥基自由基能直接與生物膜反應造成膜的脂質過氧化作用。超氧自由基（O2-·）雖然不能穿透膜系統，但能減少三價鐵離子（Fe3+）和二價銅離子（Cu2+）等過渡金屬絡合物的形成，從而影響含金屬離子酶類的活性。過氧化氫（H2O2）具有生物膜通透性以及相對較長的半衰期，這使得H2O2可以作為一種信號分子存在于植物體內。另外，H2O2也可能氧化一些酶類的巰基從而導致相關酶類的失活[4]。因此，除了ROS的毒性效應之外，ROS在一些重金屬脅迫條件下也參與了信號轉導的作用[5]。

重金屬誘導的植物體內活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）積累也是一種植物重金屬毒性的表型。RNS如一氧化氮（Nitric oxide，NO），過氧亞硝基陰離子（ONOO-），三氧化二氮（N2O3）和S-亞硝基谷胱甘肽（S-Nitrosoglutathione，GSNO）能在不同脅迫條件下產生。細胞內過量RNS誘導的亞硝基化能對DNA、膜脂類、蛋白質以及碳水化合物造成損傷，從而影響細胞功能[6]。與活性氧相似，活性氮特別是NO能觸發信號傳導途徑誘導相關抗性基因的表達[7]。NO是一種擴散性的氣體分子，在哺乳動物中被鑒定為血管內皮細胞舒張因子，是一種有效的內源性血管舒張劑[8]。后來的研究證明NO是一種具有多功能的效應因子參與多種生理過程，包括平滑肌松弛、抑制血小板聚集、神經元通訊、免疫調節、細胞凋亡和癌癥等[9]。

動物細胞主要通過一氧化氮合酶（NOS），在還原型輔酶NADPH和O2存在條件下將L-精氨酸催化生成L-瓜氨酸和NO[10]。植物體內也能合成和釋放NO，NO參與了植物體內多種生理過程，包括植物的生長與發育、過敏反應、細胞程序性死亡以及對不同脅迫的響應等，因此，NO也被認為是植物細胞內的一種通用信號分子[11]。早期的研究通過使用動物源NOS的抑制劑和抗體在不同植物材料中進行交叉反應，實驗證明了植物中存在一些NOS類的酶活性[12]。也有研究表明在擬南芥中表達大鼠神經元型NOS能顯著增加擬南芥體內NO的含量[13]。使用動物源NOS抑制劑和抗體檢測植物中NOS的方法仍然存在一些爭議，例如，Butt等[14]通過蛋白質組學的方法，使用動物源NOS抗體在玉米中鑒定到了幾種NOS類似蛋白，然而這些蛋白序列與動物源NOS序列的同源性并不高。早期研究在擬南芥中鑒定到一種NO合成酶基因（AtNOS1），其表達的酶蛋白與動物中的類似酶蛋白在序列上也沒有相似性[15]。后來的研究證明擬南芥AtNOS1并不是NO合成酶，而是與NO相關的一種環狀排列的GTP酶，并且被重命名為AtNOA1[16]。另外，Foresi等[17]也從一種單細胞綠藻（Ostreococcus tauri）中鑒定及純化得到一種具有NOS酶活性的蛋白。

植物體內通過NAD（P）H依賴的硝酸還原酶（Nitrite reductase，NR）酶促反應催化二氧化氮（NO2）和亞硝酸鹽的還原產生NO被認為是植物體內NO的主要來源[18]。擬南芥NR突變體（nia1nia2）僅具有相當于野生型1%的NR活性，而突變體植株表現出顯著減少的內源NO水平，揭示了NR參與內源NO合成的證據[19]。NO也能通過非酶促反應在酸性及還原劑或抗氧化物存在的條件下通過亞硝酸鹽的還原產生，或者以氮氧化物與植物代謝物直接化學反應的副產物形式產生[20]。盡管植物體內NO的來源具有多樣性，目前已經明確了不同脅迫響應能迅速調控NO的合成，而且NO被認為是一種重要的信號分子存在于植物體內[7]。

1 重金屬脅迫下植物體內NO的代謝

盡管NO響應植物重金屬脅迫的分子機制仍不清楚，越來越多的研究表明在植物和藻類中重金屬的毒性與植物內源NO水平存在因果聯系。很多研究在不同植物物種中揭示了不同重金屬元素對植物內源NO含量的影響（表1）。懸浮細胞系統具有可重復性、易操作等優點，是一種較為理想的研究細胞響應外界脅迫的系統。用4或7 μmol/L鎘（Cd2+）處理大豆懸浮細胞72 h，懸浮細胞顯示出快速產生NO，且NO的含量隨Cd2+濃度的增加而升高，意味著NO起著信號分子的作用[21]。也有報道表明，300 μmol/L FeSO4處理擬南芥懸浮細胞可導致細胞內快速產生大量的NO[22]。然而，通過使用NOS抑制劑和NR突變體，該研究發現NO的產生與RNS和NR活性并沒有顯著相關性[22]。也有研究發現50 μmol/L CdCl2處理擬南芥懸浮細胞并沒有對細胞產生明顯毒害，而100和150 μmol/L的CdCl2會導致細胞大量死亡，并伴隨快速的NO產生；使用NO清除劑處理細胞表明NO的產生是Cd誘導細胞死亡的重要原因[23]。在煙草BY-2細胞中也發現了相似的結果，在150 μmol/L CdCl2處理煙草BY-2細胞后，NO的含量顯著增加。進一步的研究發現使用NOS抑制劑或清除NO都能減輕Cd2+對細胞的毒害，說明增加的NO導致了Cd2+對細胞的毒害[24]。在黃瓜懸浮細胞的研究中發現Cd處理顯著增加細胞內NO，RNS和ROS的水平，且Cd誘導的NO主要在葉綠體產生，而活性氧ROS和RNS主要在胞質產生[25]。

在重金屬污染環境中，植物根系系統是與重金屬離子接觸的主要部位，因此植物根系經常被用來進行內源NO對重金屬脅迫響應的研究。在超積累植物芥菜和豌豆的根系，100 μmol/L的Cd，Cu或Zn處理都能顯著增加內源NO的產生。但不同的重金屬處理產生的NO水平并不一樣，Cd和Cu處理對內源NO產生貢獻最大[27]。在長時間鎘處理（1 μmol/L Cd2+ 處理4周）和短時間鎘處理（10 μmol/L Cd2+ 處理3 h）下的小麥根系NO含量均顯著增加[29]。在100 μmol/L Cd2+ 處理5 d的小麥根系也檢測到NO的顯著增加[28]。也有研究表明在50 μmol/L CuSO4處理24 h后的人參不定根以及1 mmol/L Cd2+ 處理24 h的大麥根尖中NO均顯著增加，通過使用NOS抑制劑的研究證明在NO產生過程中存在NOS類酶活性[30，32]。更細致的研究表明大麥根系在短時間Cd脅迫下能產生大量NO，且NO產生的部位主要在根尖[33]。也有報道表明在短時間重金屬脅迫條件下，NO的產生主要是由于NR活性的增加[29]。在200 μmol/L Cd2+處理7 h和50 μmol/L Cd2+ 處理96 h的擬南芥根系和葉片中，都觀察到NO的大量增加，然而NO的增加上調了鐵吸收相關基因的表達量而促進了鎘在根系的積累，導致了鎘對擬南芥毒性的增加[31]。在該研究中，通過使用突變體和抑制劑研究了NO產生的來源。在AtNOA1基因表達受影響的突變體atnoa1和NR1及NR2活性缺失的nia1nia2突變體中，鎘誘導的NO產生并沒有受到抑制，表明AtNOA1和NR都不能催化NO的合成。另外，在使用動物源NOS抑制劑處理導致根系鎘誘導的NO產生顯著減少，說明在NO產生過程中可能存在NOS類酶活性[31]。在不同濃度CuSO4處理下的萊茵衣藻中也觀察到隨著處理時間和處理濃度的增加，NO的積累也增加，且與脯氨酸的合成存在顯著相關性[26]。

與以上研究結果相反，也有一些研究表明重金屬脅迫對NO的產生存在負調控效應。例如，鋅超積累植物龍葵在Zn2+ 或Zn2+ 加Fe2+ 共同處理2 d，NOS抑制劑能完全抑制NO的積累，然而，NO的產生在接下來的8 d重金屬處理中顯著減少[34]。90 μmol/L Al處理擬南芥1 h就能顯著減少擬南芥根系NO的產生，100 μmol/L Al處理20 min能抑制秋葵幼苗根系中NO的產生，這些重金屬脅迫可能都是通過抑制NOS類酶活性而減少NO的合成[35，36]。另外的研究表明50 μmol/L Cd2+ 處理48 h可以顯著減少苜蓿根系NO的含量，50 μmol/L Cd2+ 處理14 d也能顯著減少豌豆根系和葉片中NO的含量[37，38]。Xiong 等[39]發現100 μmol/L Cd2+ 處理24 h能顯著減少7 d大小水稻幼苗冠根中NO的含量，而用0.2 mmol/L Cd2+ 處理4周大小的水稻苗，NO的含量在處理的前30 min內顯著增加，之后NO含量卻顯著下降。

重金屬對植物體內NO產生具有誘導和抑制的矛盾效應很可能與NO在植物體內具有保護和毒害兩種效應相關，這可能與NO在植物體內的濃度有關[40]。總之，這些重金屬對不同植物內源NO含量的影響矛盾的報道目前依然存在爭論，一些可能的原因也被提出。例如，重金屬處理時間的長短會引起細胞不同的反應，短時間重金屬處理導致NO的大量產生，而長時間處理直接或間接地減少了NO的產生[38]。另一種解釋可能與重金屬濃度、植物的大小以及不同植物組織有關[28，39]。另外，NO也能與氧發生反應生成一些氮氧化物，因此，內源NO水平依賴于其本身濃度、細胞內氧化還原狀態以及目標分子和重金屬對NO的利用情況之間復雜的平衡[41]。最后，對NO的檢測和定量上的技術問題也可能是重金屬對植物內源NO含量的影響具有爭議的一種原因。到目前為止，已有多種方法用來檢測植物不同器官、植物細胞、純化的過氧化物酶以及線粒體中NO的產生，包括熒光成像、化學發光、電子自旋共振（ESR）、基于量子級聯激光器的光譜檢測、激光光聲成像檢測、NO電極和膜進樣質譜檢測（MIMS）等[42]。所有這些技術都有各自的優缺點，對檢測結果也可能產生較大差異。總之，NO濃度的變異和一些試驗結果的矛盾可能是由于檢測方法的差異引起的，因此在同一試驗條件下需要至少使用兩種以上的方法進行檢測以確保NO檢測的準確性[42]。

2 NO對植物重金屬毒害的保護作用

NO是一種擴散性氣體信號分子，在植物中具有廣泛的生理作用。除了調控植物正常的生長發育，NO在不同生物和非生物脅迫響應中也起著重要作用。NO在植物體內可以通過消除超氧自由基以及形成低毒性的過氧亞硝酸鹽而起著抗氧化劑的作用[43]。另一方面，體內高濃度NO對植物產生毒害，主要表現在對細胞膜的損傷，誘導DNA斷裂，抑制一些可能的抗氧化酶如過氧化氫酶的活性從而導致ROS的累積[7]。在過去的20年，對NO供體的研究快速增加暗示著外源施用NO能提供對植物重金屬毒害的保護，一些關于NO對特定重金屬如鋁和鎘毒害的保護作用也已經被報道[44，45]。NO通過減少或區隔化重金屬累積或減弱重金屬誘導的氧化脅迫來保護植物細胞免受重金屬的毒害這一觀點現在已經被廣泛接受。例如（表2），外源施加50 μmol/L硝普鈉（SNP）作為NO供體能通過清除水稻根系ROS保護水稻根系免受砷酸鹽的毒害，從而減少水稻根系細胞氧化損傷[46]。用10 μmol/L SNP處理黃羽扇豆幼苗24 h，可以顯著減輕 Pb2+和Cd2+對根系生長及形態發生的抑制。SNP能通過刺激超氧化物歧化酶（SOD）的活性和/或直接清除超氧化物陰離子而抵消重金屬對根系生長的抑制效應[47]。50 μmol/L SNP處理能增加三葉草抗氧化系統活性，從而有效減輕重金屬鎘對三葉草的毒性[48]。100 μmol/L SNP預處理番茄幼苗能有效減輕重金屬銅對番茄的毒性，其主要是通過增加抗氧化酶如過氧化氫酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性和增加金屬硫蛋白的積累[49]。10 μmol/L SNP處理能減輕酸柚幼苗鋁誘導的生長抑制和整個光合電子傳遞鏈的損傷，通過增加鋁誘導的根系蘋果酸和檸檬酸的分泌減弱根系鋁的的移動性從而減少鋁在地上部的積累[50]。SNP也能通過增強小麥幼苗抗氧化酶如過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽還原酶（GR）和谷胱甘肽S-轉移酶（GST）的活性而顯著減輕鎳（Ni）對小麥幼苗生長的抑制[51]。另外，100 μmol/L SNP能通過調節植株體內巰基的含量，增加還原性谷胱甘肽含量和SOD活性來減輕小麥和菜豆幼苗中鋅缺乏和毒性的不利影響[52]。最后，也有很多研究表明外源施加NO對多種植物在鎘脅迫下的保護作用是通過調節植物體內抗氧化酶活性來實現的[45]。

盡管也有研究報道高濃度的外源NO反而會增加重金屬對植物毒性，單一高濃度外源NO處理也能抑制植物的生長[28，37，38]，然而大量的研究揭示了外源NO在保護植物免受重金屬的有害影響方面具有重要作用，也闡明了NO能幫助植物抵消重金屬脅迫的可能機制。首先，通過清除芬頓反應產生的過氧自由基和對抗氧化酶的調節，NO能增加植物體內抗氧化物含量以及抗氧化酶活性[7]。其次，NO通過影響細胞壁成分，如果膠、半纖維素和纖維素等，促使重金屬在根系細胞壁的累積，因此而減少植物地上部重金屬的積累[53]。第三，NO能通過轉錄激活耐性相關基因和對目標蛋白翻譯后的修飾如對特異半胱氨酸位點的S-亞硝基化從而調控細胞反應[54]。另外，NO通過調節吲哚-3-乙酸氧化酶的活性來維持體內生長素的平衡從而減輕重金屬對植物的毒害[37]，同時通過調節一些蛋白激酶、Ca2+通道和轉運蛋白的活性增加細胞質Ca2+濃度，或者動員另外一些二級信號因子如環鳥苷酸（cGMP）和環腺苷二磷酸核糖（cADPR）參與信號級聯放大，從而調控相關基因表達[31]。

3 展望

NO作為植物和動物中一種擴散性氣體信號分子，具有廣泛的生理功能。除了調節植物正常生長和發育，NO在響應不同生物與非生物脅迫過程中具有重要作用。不同重金屬對不同植物或同一植物不同組織間NO累積具有不同的影響，這些不同的影響可能是由于不同重金屬濃度的使用，不同植物物種和不同植物組織的選擇，不同植物大小和不同的處理時間造成的。

近來，越來越多的研究表明施用外源NO具有減輕重金屬對植物毒害的作用，NO的這種保護作用很可能是因為NO具有增加植物體內抗氧化物含量，抗氧化酶活性和調控脅迫相關基因的表達的能力。另一方面，重金屬誘導的NO積累也可能增加重金屬毒性。在NO與重金屬毒性的關系上存在的這些矛盾的結果，可能是由于不同重金屬對不同植物種類或同一植物不同組織間的NO含量的影響不同，也揭示了植物中NO的產生具有不同來源。另外，需要考慮的是外源施用NO供體可能不能精確反應植物體內NO信號的時空特征[40]。

重金屬脅迫與NO關系的大量不一致的文獻報道強有力地表明這種信號分子具有多種功能屬性，如氧化與抗氧化特征、有害與有益特征、抑制與誘導特征等。然而NO響應植物重金屬脅迫的分子機制仍不清楚，有待進一步深入研究。另外，發展更好的實驗系統準確監測植物體內NO的含量，對于理解植物響應重金屬脅迫的復雜網絡和NO調控細胞響應這些脅迫機制也是非常必要的。

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