一株好氧反硝化細菌的篩選、鑒定及紫外誘變

摘要：從牛蒡（Arctium lappa L.）根際土壤中分離到1株具有較高反硝化能力的好氧細菌YB000，對該菌株采用生理生化及分子生物學方法進行了鑒定，并且對該菌株進行了以提高反硝化性能為目的的紫外誘變。結果表明，分離自牛蒡根際的反硝化細菌經鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），該菌株于距離30 W紫外燈30 cm處照射240 s可獲得具有較強脫氮能力且遺傳性狀穩定的誘變菌株YB004和YB005，其脫氮能力分別達到93.43%、92.03%。

關鍵詞：好氧反硝化細菌；牛蒡（Arctium lappa L.）；根際土壤；篩選；鑒定；紫外誘變

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）13-3305-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.010

隨著水產養殖業的迅猛發展、含氮工業廢水的排放及農業中化肥的過量施用，導致水體氮素含量嚴重超標而影響水體的使用安全[1，2]。氮素超標是導致水體富營養化的重要原因之一，生物脫氮可有效去除水體中的氮元素[3]。傳統的生物脫氮包括硝化和反硝化兩個過程，反硝化脫氮能將硝酸鹽氮或亞硝酸鹽氮轉化為氣態氮，從根本上解決水體中氮素超標的問題。反硝化細菌是能夠引起反硝化作用的細菌，多為異養、兼性厭氧細菌[4]，但近期研究表明，一些微生物在較高的氧分壓條件下也能表現出反硝化能力[5-8]。好氧反硝化作用實現了硝化和反硝化作用的同時進行，不僅簡化了生物脫氮流程、降低了投資成分，而且還表現出了傳統廢水處理方法所無法比擬的優勢，如硝化過程無需加堿中和、脫氮效率高、對氨態氮耐受能力強等[9]。所以好氧反硝化作用是生物脫氮的全新途徑，好氧反硝化菌的發現為該途徑的充分應用提供了可能。本研究從牛蒡（Arctium lappa L.）根際土壤分離純化出1株具有較高反硝化性能的好氧細菌，并對該菌進行了以提高反硝化能力為目的的紫外誘變，以其獲得高效、穩定的好氧反硝化細菌，為好氧反硝化在生物脫氮過程中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

分離自牛蒡根際。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×Amplification buffer購自生工生物工程（上海）有限公司。所用其余試劑均為分析純。

主要儀器：9700型PCR儀（Applied Biosystems公司）；凝膠成像系統（Bio-Rad Gel Doc XR+美國伯樂）；DYCZ-40D型電泳儀（北京六一儀器廠）；HH.B11.600-S-II型電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）；HH-8型數顯恒溫水浴鍋（金壇市晶玻實驗儀器廠）；7230G型可見分光光度計（上海洪紀儀器設備有限公司）；BBS-SSC型潔凈工作臺（上海京工實業有限公司）；HNY-100C型恒溫培養搖床（常州中誠儀器制造有限公司）；YXQ型手提式壓力蒸汽滅菌鍋（嘉興市中新醫療儀器有限公司）。

1.3 引物

16S rDNA引物A1序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；引物A2序列：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′，分別對應大腸桿菌（Escherichia coli） 16S rDNA的8～27 bp和1 495～1 514 bp，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 培養基

富集液體培養基：20%KNO3，2%MgSO4，10%K2HPO4，10%KH2PO4，50%檸檬酸鈉，pH 7.2～7.6。

富集固體培養基：20%KNO3，2%MgSO4，10%K2HPO4，10%KH2PO4，50%檸檬酸鈉，2%瓊脂，pH 7.2～7.6。

反硝化顯色固體培養基：10%葡萄糖，1%酒石酸鉀鈉，20%KNO3，2%K2HPO4，5%CaCl2，2%瓊脂，1%BTB（溴麝香草酚蘭）乙醇溶液[10]。

1.5 方法

1.5.1 牛蒡根際土壤的采集 于江蘇省徐州市豐縣牛蒡種植基地，使用五點采樣法采集牛蒡根際土壤于無菌袋中避光、低溫保存。

1.5.2 反硝化細菌的富集培養及分離純化 準確稱取土樣1.0 g于10 mL去離子水中，并在振蕩器上充分振蕩15 s。待土樣沉淀后取1 mL上清液接種于反硝化液體培養基，并于30 ℃恒溫振蕩培養箱中培養3～14 d至培養基渾濁。

取1 mL上述富集培養菌液涂布于反硝化顯色固體培養基，置于30 ℃恒溫培養箱中培養至長出菌落，取單菌落接種在富集固體培養基中繼續培養。重復上述操作，直至獲得純菌種[11，12]。

1.5.3 反硝化細菌生理生化鑒定

1）革蘭氏染色。在干凈玻片上滴1滴去離子水，用接種針挑取少量菌落涂布于水中，風干固定。加入結晶紫混合液作用1 min，水洗。碘液染色1 min，水洗，吸干。95%乙醇溶液脫色，水流洗脫至洗脫液無色（約30 s）。用番紅液染色2～3 min，水洗、風干。挑取生長良好的菌落進行染色，顯微觀察多個視野。

2）鞭毛染色。挑取少許菌苔，涂布在玻片上的無菌水中，風干固定。滴加酸化的FeCl3溶液染色10 min，沖洗后將殘水瀝干，加2%AgNO3溶液染色30～60 s，加熱，冷卻后用去離子水沖洗。顯微觀察。

3）半固體瓊脂穿刺法。用接種針穿刺接種菌液于半固體培養基內，30 ℃培養10 d，用透射光目測其生長狀況。

4）甲基紅試驗。接種菌液在加入甲基紅試劑的培養基中于30 ℃培養2～6 d，同時以不加入甲基紅試劑的培養基為對照。

5）V-P試驗。接種菌液于甲基紅培養液中，30 ℃培養6 d。取培養液和40%NaOH等量混合，加入少量肌酸作用10 min。

6）顯色培養。將富集培養液接種于反硝化顯色培養基中，劃線接種反硝化菌種，置于30 ℃培養箱中培養7 d。

1.5.4 反硝化細菌特殊生理生化鑒定

1）反硝化試驗。配制反硝化培養基，接種反硝化菌種，封管后以不含硝酸鉀的培養基作為對照。培養1～7 d，觀察含有硝酸鉀的培養基中有無生長和是否產生氣泡，如產生氣泡表示有反硝化作用產生氮氣，是陽性反應，不產生氣泡則為陰性。

2）硝酸鹽還原試驗（格利斯試驗）。在干凈的白瓷板中倒入少許培養1、3、5 d的菌液，再各加1滴磺胺-乙酸溶液及α-萘酚-乙酸溶液，觀察其顏色變化。

3）氮元素檢測方法[13]。α-萘胺分光光度法測定亞硝酸鹽氮；納氏試劑分光光度法測定氨氮含量；酚二磺酸分光光度法測定硝酸鹽氮。

1.5.5 分子生物學鑒定

1）菌種DNA的提取與檢測。參照文獻[14]的方法進行。取2 μL DNA樣品采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2）菌種16S rDNA基因PCR擴增。反應體系ddH2O 29.7 μL，10×Amplification buffer（不含Mg2+） 5 μL，dNTPs（2 mmol/L）5 μL，Mg2+（25 mmol/L）3 μL， A1（10 μmol/L）2 μL，A2（10 μmol/L）2 μL，基因組DNA（30 ng/μL）3 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.3 μL，反應總體積50 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃復性30 s，72 ℃延伸45 s，循環35次；72 ℃ 延伸10 min。將100 μL PCR產物送交生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.5.6 菌種的紫外誘變 取50 μL菌液均勻涂布于反硝化固體培養基中，于距離30 W紫外燈下30 cm處進行誘變。誘變時間分別為10、20、30、40、50、60、120、240、360、480、600 s。將誘變后的平板用黑布包裹后置于30 ℃通風干燥培養箱中培養2 d。觀察固體培養基中菌落生長情況，確定誘變時間范圍，計算致死率。致死率=（未誘變的再生菌落數-誘變后的再生菌落數）/未誘變的再生菌落數×100%。

2 結果與分析

2.1 菌落形態特征分析

菌種經反復富集、分離培養后，接種于分離培養基上，其菌落形態見圖1。從圖1可以看出，菌種菌落呈圓形、白色、邊緣整齊、表面光滑濕潤。

2.2 生理生化鑒定結果

菌種為革蘭氏陰性菌，有鞭毛，有運動性，甲基紅陰性，能發酵葡萄糖，V-P反應呈陽性，可分解利用淀粉，菌液中有過氧化氫酶存在，具有硝酸鹽還原能力。菌種生理生化特征總結見表1。

2.3 分子生物學鑒定

2.3.1 DNA電泳檢測 取2 μL DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。由圖2可以看出，D1、D2的條帶清晰，無斷裂、拖尾現象，說明提取的DNA較完整，可用其進行PCR擴增試驗。

2.3.2 PCR擴增結果 取5 μL PCR擴增產物進行電泳檢測，結果見圖3。由圖3可以看出，該試驗菌采用引物A1、A2進行16S rDNA PCR擴增，得到約 1 500 bp的片段，條帶單一，沒有其他雜帶，可用于測序。

在Genbank上查找其同源序列發現，該序列與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CGL-2（登錄號EU147006）相似度達95.8%。

2.4 高脫氮性能菌株的紫外誘變篩選

2.4.1 紫外誘變時間的確定 將分離純化出的原始好氧反硝化菌株命名為YB000，將經不同劑量的紫外線誘變處理后的YB000菌株單孢子菌懸液分別涂布于固體培養基平板上，每批單孢子菌懸液涂布3只平板。平板培養后計數存活菌落數，以不經誘變的平板菌落數為對照，計算誘變致死率，結果見表2。從表2可以看出，隨著紫外線處理時間的延長，菌體的致死率隨之上升，照射360 s時達到81.7%，到600 s時達到100%。研究表明，致死率在80%左右的突變一般為正突變[15]，因此，本研究選用的誘變時間為360 s。

2.4.2 高脫氮性能菌株的篩選 菌株經紫外誘變后，獲得6株生長較快的誘變菌株。對原始菌株（YB000）及誘變菌株（YB001-YB006）進行液體搖瓶發酵（100 mL培養液/250 mL三角瓶），每天測定發酵液中硝酸鹽氮含量以確定菌株的脫氮能力，測定結果如表3所示。由表3可以看出，隨著培養時間的延長，培養液中硝酸鹽氮的含量逐漸降低，后期逐漸趨于平緩。誘變菌株中YB003菌株、YB004菌株、YB005菌株脫氮能力較強，脫氮率分別達到80.72%、92.23%、91.81%。

2.4.3 菌株遺傳穩定性檢測 對經過誘變后獲得的突變菌株YB003、YB004和YB005利用群體傳代法進行遺傳穩定性分析。發現YB004和YB005菌株的脫氮性能和遺傳特征穩定，YB003菌株傳至第三代時，其脫氮性能顯著下降，說明YB003菌株遺傳性狀不穩定。故選擇YB004和YB005菌株為高效脫氮誘變菌株。

2.4.4 誘變菌株與原始菌株脫氮能力的比較 對原始菌株YB000和誘變菌株YB004、YB005進行脫氮能力比較，發現在相同培養條件下原始菌株的脫氮能力為63.78%，而YB004和YB005脫氮能力分別達到93.43%、92.03%，顯著高于原始菌株。說明經紫外誘變選育獲得的誘變菌株的脫氮能力得到了較大幅度的提高。

3 小結與討論

1）物理誘變中紫外線誘變操作簡便，誘變時間易于控制，且作用相對溫和，因而是誘變育種的首選方式之一。本試驗結果也進一步證實了紫外誘變這一優勢。誘變后的黑暗處理必不可少，可防止發生光復活效應。有報道稱，致死率在80%左右發生正向突變概率高[15]，也有報道表明致死率在90%～99%誘變效果好[16]。本試驗結果表明，致死率在80%左右獲得的反硝化細菌誘變株反硝化性能較好，主要由于反硝化細菌反應活性及生長速度易受到外界條件的影響，在高致死率下菌種很難生長，因此在紫外誘變中，正向突變可能較多地出現在偏低劑量中。

2）具有反硝化功能的微生物分布非常廣泛，與系統分化無關，在近20年，Zumft[17]就記錄了130余種，有超過50個屬的生物具有反硝化功能。目前，更多的研究證實具有反硝化功能的微生物從遺傳距離很遠的細菌到太古菌甚至是真菌中都有發現。因為存在多樣性，許多反硝化菌也執行氮循環過程中的其他功能，例如氨氧化[如亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira）]和固氮[如根瘤菌屬（Rhizobium）、固氮螺菌屬（Azospirillum）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）]。因此，反硝化群落的研究并不像其他群落研究那樣容易，擁有反硝化功能的反硝化菌在進化上沒有緊密的聯系，不適合用16S rDNA系統進化樹來分析。因此，利用編碼反硝化酶的功能基因來研究反硝化菌應是下一步研究的重點。根據生理生化和分子生物學試驗結果，結合細菌分類學手冊，判斷從牛蒡根際微生物中分離到的具有反硝化功能的試驗菌為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

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