黃精多糖的柱前衍生化HPLC指紋圖譜研究

摘要：為了建立黃精多糖組成糖的指紋圖譜，采用柱前衍生化HPLC法測定黃精多糖的組成，并建立其組成糖的指紋圖譜。色譜柱為Agilent ZORBAX XDB C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），以0.025 mol/L磷酸鹽緩沖液（KH2PO4-NaOH，pH 6.8）-乙腈為流動相進行梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測波長為250 nm。結(jié)果顯示，黃精多糖有4個共有峰，分別為甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖，對10批樣品進行相似度分析，其相似度大于0.98。采用HPLC法建立多糖的指紋圖譜操作簡便、選擇性高、分析速度快，可有效檢測黃精多糖。

關(guān)鍵詞：黃精多糖；柱前衍生化；高效液相色譜；指紋圖譜

中圖分類號：O657.7+2；R282.7l 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）13-3462-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.049

中藥材黃精又名老虎姜、雞頭參、玉竹，始載于《名醫(yī)別錄》，是百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum）滇黃精（Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl）、黃精（Polygonatum sibiricum Red.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥莖根[1]。黃精的主要活性成分是黃精多糖，現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，黃精多糖具有降低血糖、血脂，抗病毒，延緩衰老，增強機體免疫功能等作用[2-6]。中國是生產(chǎn)植物提取物的大國，但目前提取物市場還比較混亂，建立黃精多糖的特征圖譜，有利于黃精多糖質(zhì)量管理的規(guī)范。多糖中決定其活性的因素主要有組成糖、分支度、糖苷鍵的連接方式等，其中，組成糖測定比較簡單、可控。故選擇采用柱前衍生化的方法測定黃精多糖的組成，并建立其指紋圖譜。此方法操作簡便、重現(xiàn)性好，可作為評價黃精多糖質(zhì)量的手段之一。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

黃精，購自超市，由長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室鑒定；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）和三氟乙酸（TFA）均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，其他試劑為分析純，水為超純水。甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖（Gal）、半乳糖醛酸（GalA）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）、鼠李糖（Rha）、巖藻糖（Fuc）均購自Sigma公司，純度均99%以上。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；AB204-N型分析天平，Mettler-Toledo儀器上海有限公司。

1.3 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX XDB C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；以0.025 mol/L磷酸鹽緩沖液（KH2PO4-NaOH，pH 6.8）-乙腈（85∶15，V/V）為流動相A，以0.025 mol/L磷酸鹽緩沖液（KH2PO4-NaOH，pH 6.8）-乙腈（60∶40，V/V）為流動相B。梯度洗脫比例為0 min-10 min-30 min-0 min，B為0%-8%-30%-0%；流速為0.8 mL/min；柱溫為40 ℃；檢測波長為250 nm；進樣量5 μL。

1.4 對照品溶液制備

取葡萄糖等9種單糖各2 mg，置螺帽試管中，分別加2 mL水溶解，加入0.3 mol/L NaOH溶液 1 mL，再加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液1.2 mL，混勻，密封，置70 ℃水浴中反應(yīng)30 min，取出，冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至中性，混勻，用等體積氯仿萃取3次，取水層，吹干，殘渣加 2 mL甲醇溶解，取續(xù)濾液，作為對照品溶液。

1.5 供試品溶液制備[7]

1.5.1 黃精多糖的提取 稱取黃精飲片200 g，加入8倍量的水進行煎煮，每次2 h，煎煮3次，過濾，合并水提液，濃縮至一定體積，向其中緩慢加入無水乙醇至乙醇濃度為80%，靜止過夜，離心，棄去上清液，沉淀揮干法去掉乙醇，凍干，即得黃精多糖。

1.5.2 黃精多糖的酸水解 精確稱取黃精多糖 5 mg，置螺帽試管中，加入2 mol/L TFA溶液2 mL，混勻，密封，置100 ℃烘箱中水解8 h，吹干，殘渣加1 mL甲醇，吹干以除去多余的TFA，反復(fù)3次，殘渣加2 mL水溶解，即得黃精多糖酸水解溶液。

1.5.3 PMP衍生化 將黃精多糖酸水解溶液中加入0.3 mol/L NaOH溶液1 mL，再加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液1.2 mL，混勻，密封，置70 ℃水浴中反應(yīng)30 min，取出，冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl溶液1 mL調(diào)節(jié)pH，混勻，用等體積氯仿萃取3次，取水層，吹干，殘渣加2 mL甲醇溶解，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 精密度試驗 取上述供試品溶液，連續(xù)進樣6次測定，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積，通過相似度軟件計算相似度。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD均小于0.3%；相對峰面積比值的RSD小于3%，相似度接近于1.0，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

1.6.2 穩(wěn)定性試驗 分別于0、4、8、12、18、24 h進樣測試，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積，通過相似度軟件計算相似度。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD均小于0.3%；相對峰面積比值的RSD小于3%，相似度接近于1.0。可見供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.6.3 重復(fù)性試驗 取黃精多糖6份，制備測定，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積，通過相似度軟件計算相似度。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD均小于0.3%；相對峰面積比值的RSD小于3%，相似度接近于1.0，結(jié)果表明此方法的重復(fù)性良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 混合單糖對照品的分析 將對照品溶液按照色譜條件進樣，結(jié)果見圖1。由圖1可見，9種單糖均得到較好分離。

2.1.2 共有峰的確定及參照峰的選擇 將對照品溶液按照色譜條件進樣，測定10批樣品，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，不同批次的樣品均具有一致的特征峰，共標示出4個共有峰。對比圖1和圖2各色譜峰的保留時間可知，4個共有峰分別為甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖，其中，葡萄糖的含量最高，故選定葡萄糖作為參照峰（S），以參照峰（S）分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表1、表2。

2.2 相似度評價

將10批供試品HPLC圖譜進行評價，使用國家藥典委員會發(fā)表的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件。10批樣品色譜峰的共有模式見圖3，10批供試品的相似度見表3，表明10批供試品具有較好的相似度。

2.3 試驗條件考察

2.3.1 黃精多糖水解時間 分別考察水解4、6、8、10 h制備衍生化樣品并考察其峰面積。結(jié)果顯示，水解4、6、8 h所得到的單糖峰面積呈上升趨勢，水解8 h和10 h所得到的單糖峰面積沒有變化，表明8 h已水解完全，故選擇水解時間為8 h。

2.3.2 流動相選擇 根據(jù)文獻[8-10]報道的色譜條件，分別考察乙腈-醋酸銨緩沖液（醋酸銨-冰醋酸，pH 5.5）系統(tǒng)、磷酸鹽緩沖液（KH2PO4-NaOH，pH 6.8）-乙腈梯度洗脫、磷酸鹽緩沖液（KH2PO4-NaOH，pH 6.7）-乙腈等度洗脫效果。結(jié)果顯示，所選擇的流動相洗脫系統(tǒng)及比例得到的各峰之間的分離度較好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求，故選定此條件為黃精多糖指紋圖譜的洗脫條件。

2.3.3 色譜柱選擇 試驗中在其他色譜條件相同的情況下，選用Grace Apollo C18、Agilent ZORBAX XDB C18、Unitary-C18、SHIMADZU VP-ODS C18分別進樣。結(jié)果表明，Agilent ZORBAX XDB C18色譜柱基線分離較好，峰形對稱性好。

3 小結(jié)

PMP柱前衍生化法反應(yīng)條件較溫和，產(chǎn)物純度高，無立體異構(gòu)現(xiàn)象，紫外檢測靈敏度較高，得到較為廣泛的應(yīng)用[11]。本試驗采用PMP柱前衍生化HPLC法建立黃精多糖的指紋圖譜，并采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件進行評價分析，結(jié)果表明采用HPLC建立指紋圖譜重現(xiàn)性好、結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于黃精多糖的質(zhì)量控制。

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