人CYP27B1真核表達構建及其在293T細胞表達

摘要：CYP27B1是血清活性維生素D3合成的關鍵酶，根據GenBank報道的序列設計特異引物，以HepG2細胞的cDNA為模板，擴增CYP27B1的編碼區，構建CYP27B1的真核表達載體，在293T細胞表達并檢測其催化活性。結果表明，重組表達載體pcDNA-CYP27B1構建成功，pcDNA-CYP27B1及對照質粒pcDNA分別瞬時轉染293T細胞。Western blot檢測結果表明CYP27B1在293T成功表達。HPLC檢測結果顯示重組表達的CYP27B1能羥化25（OH）D3生成1α，25（OH）2D3。

關鍵詞：CYP27B1；真核表達載體；羥化；HPLC

中圖分類號：Q554 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）13-3486-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.056

維生素D是一種脂溶性維生素，屬于類固醇化合物，又稱抗佝僂病維生素[1]。在動物體體內，皮膚中的7-脫氫膽固醇經紫外照射轉化為維生素D3。此外，維生素D3來源于一些食物，如魚、動物肝臟、奶制品、酵母、蘑菇等[2，3]。維生素D的生理功能是調節鈣磷代謝，通過促進腸的鈣磷吸收和腎的重吸收以提高血漿鈣磷離子濃度[4]。近年來，也發現1α，25（OH）2D3在腎外組織及細胞中發揮重要的生物功能，如調節靶細胞的分化、增殖或功能。研究發現腎外活性維生素D的調控作用與腫瘤、免疫調節、抗炎效應等相關[5，6]，因此，吸引了學者研究1α羥化酶表達水平與疾病尤其是腫瘤發生的相關性，據報道維生素D依賴型佝僂病1（VDDR1）和假性維生素D依賴型佝僂病（PDDR）與1α羥化酶活基因突變相關[7，8]。

維生素D3沒有生物活性，為了發揮其生物效應，必須被代謝成具有生物活性形式的維生素D。首先，維生素D3與維生素D3結合蛋白（DBP）結合，轉運到肝臟，被細胞色素P450羥化為初具生物活性的25-hydroxyvitamin D（25（OH）D3），25（OH）D3是維生素D的主要循環形式，臨床上應用25（OH）D3反映體內維生素D的營養狀態[5，9]，25（OH）D3被轉運到腎臟，被1α羥化酶CYP27B1轉化為最強生物活性的1α，25（OH）2D3[10]。

CYP27B1是線粒體膜蛋白質，哺乳動物線粒體單氧酶系統包括NADPH-鐵氧還蛋白還原酶（Adr）和鐵氧還蛋白（Adx）和P450，電子從NADPH經Adr和Adx傳遞到P450[11]。Tang等[12]應用GroEL/ES作為分子伴侶在大腸桿菌中成功地將CYP27B1與Adx和Adr共表達，并且獲得部分純化的異源表達重組蛋白。但是，真核體系表達的蛋白具有天然構象并且不需要分子伴侶與電子傳遞體共表達的優點，所以本研究應用PCR擴增CYP27B1的編碼區，構建其表達載體pcDNA-CYP27B1，重組質粒瞬時轉染293T細胞，HPLC檢測其催化活性，為研究CYP27B1表達量對細胞增殖和凋亡的影響提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2細胞購和293T細胞購（ATCC公司），維生素D3和25（OH）D3（Sigma公司），1α，25（OH）2D3（Santa Cruz公司），pcDNATM 3.1/myc-His（-）A vector和Trizol（Invitrogen公司），限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ（Takara公司），高保真酶KOD FX（Toyobo公司），K1621 RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒（Thermo公司），DMEM培養基、胎牛血清、胰酶、青霉素和鏈霉素（Gibco公司），Myc抗體、HRP標記的小鼠抗山羊IgG（碧云天生物科技有限公司），PVDF（Millipore公司），DNA膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒和微量質粒提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，GenEscortTMⅠ（Polysciences公司），甲醇為色譜級，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HepG2細胞培養：DMEM完全培養基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素），37 ℃，5% CO2。復蘇的細胞鋪板率達90%以上，0.25%胰酶消化，1×104個/孔細胞接種于六孔板，生長48 h后，收集細胞用于RNA提取。293T細胞培養條件同HepG2細胞。

1.2.2 表達載體構建 采用Trizol法從HepG2細胞中提取總RNA，詳細步驟參照Trizol的說明書，反轉錄按照K1621 RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒說明操作。根據NCBI報道的CYP27B1的序列（登錄號：1594），設計特異性引物F（5′-CCGCTCGAGATGACCCAGACCCTCAAGTACGC-3′）、R（5′-CGGGATCCTCTGTCCAAAAACTGTAGGTTGATGC-3′），在編碼區的5′和3′端分別引入XhoⅠ和BamHⅠ限制性內切酶酶切位點，并去掉CYP27B1編碼區的TGA，在CYP27B1的3′端融合載體的myc-His標簽，利用載體的終止子終止翻譯。以HepG2的cDNA為模板，用KOD FX高保真酶擴增CYP27B1的編碼區，55 ℃退火，其他步驟參見說明書。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收CYP27B1片段。XhoⅠ和BamHⅠ限制性內切酶雙酶切PCR產物和pcDNATM 3.1/myc-His（-）A載體過夜，DNA純化試劑盒回收酶切產物。將回收的CYP27B1雙酶切產物與回收的pcDNATM 3.1/myc-His（-）A載體的雙酶切產物連接過夜，轉化到E. coli DH5α感受態中，37 ℃生長16 h后，菌液PCR篩選陽性轉化子，將陽性轉化子進行DNA測序，保存序列正確的質粒。

1.2.3 293T細胞瞬時轉染 傳代后的第二天，細胞鋪板率達到60%以上，但是生長不能超過24 h，然后進行轉染。10 cm平皿， 8 μg質粒，24 μL GenEscortTMⅠ（PEI），詳細操作步驟參見GenEscortTMⅠ的說明書。轉染24 h后加入終濃度為1 μmol/L 25（OH）D3，孵育24 h后，收集細胞和培養基，加入4倍體積的抽提液（體積比為3∶1的氯仿和甲醇）渦旋振蕩2 min，室溫3 000 r/min離心10 min. 有機相在氮氣流下吹干，加入200 μL甲醇溶解，10 μL用于HPLC檢測。

1.2.4 Western-blot檢測 pcDNA-CYP27B1和空載體pcDNA轉染后48 h，PBS洗滌細胞2次，收集細胞，用PBS懸浮，超聲破碎，總蛋白質濃度用Bradford方法測定。在5 μg蛋白質樣品中加入等體積的Loading buffer混勻后煮沸失活，樣品用SDS-PAGE分離，轉膜2 h，5%脫脂奶4 ℃封閉過夜，TBST洗膜3次；將myc抗體稀釋1 000倍，室溫孵育2 h，洗膜3次；HRP標記的小鼠抗山羊IgG稀釋3 000倍，室溫孵育2 h，洗膜3次。

1.2.5 HPLC檢測 采用安捷倫1200液相色譜儀，ZORBAX Eclipse Plus C18 column色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流速1 mL/min，檢測波長265 nm，流動相 A為水，流動相B為甲醇。0～10 min，85%～100%甲醇；10～18 min 100%甲醇洗脫，柱溫40 ℃。

2 結果與分析

2.1 CYP27B1真核表達載體構建

以HepG2的cDNA為模板，應用引物F和R擴增CYP27B1的編碼區。擴增后的PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得約1 500 bp的目的條帶，得到預期大小的產物（GenBank報道的CYP27B1的編碼區為1 527 bp），如圖1所示。將目的片段電泳后回收連接，轉入大腸桿菌E. coli DH5α感受態細胞，進行菌落PCR鑒定，將陽性克隆測序。測序結果顯示PCR產物為CYP27B1基因，在編碼區3′端融合了載體的myc-His。

2.2 Western-blot檢測重組蛋白表達

5 μg蛋白質樣品中加入等體積的Loading buffer，混勻后煮沸失活，樣品用SDS-PAGE分離，再經Western-blot鑒定。CYP27B1編碼區編碼508個氨基酸，分子量為56.504 21 kDa的蛋白質，重組蛋白質3′端具有myc-His標簽，編碼59 938.9 kDa大小的重組蛋白，用Myc抗體作為一抗，經Western-blot檢測到預期大小的目的蛋白，如圖2所示，表明CYP27B1在293T細胞中成功表達。

2.3 CYP27B1生物活性檢測

pcDNA-CYP27B1和空載體pcDNA瞬時轉染293T細胞，24 h后加入終濃度為1 μmol/L的25（OH）D3，孵育24 h，加入抽提液終止反應，抽提底物和產物。pcDNA-CYP27B1瞬時轉染293T細胞的提抽物中檢測到了1α，25-雙羥基維生素D3，對照空載體pcDNA瞬時轉染293T的提抽物中未檢測到1α，25-雙羥基維生素D3，3次重復。結果（圖3、圖4）表明，在293T異源重組表達CYP27B1中能催化25（OH）D3在C-1a位單加氧生成1α，25-雙羥基維生素D3。

3 討論

人CYP27B1的cDNA全長包含9個外顯子，全長2 503 bp，包括 152 bp 的5′端的非編碼區，1 527 bp的開放閱讀框架序列，824 bp的3′端的非編碼區。 CYP27B1除了在腎表達外，在肝等腎外組織也表達。Tang等[12]應用化學合成CYP27B1的編碼區，并且原核表達CYP27B1。本試驗設計特異性引物以HepG2細胞的cDNA為模板，用KOD FX高保真酶擴增CYP27B1的編碼區，KOD FX與一般高保真酶相比，擴增效率高。本試驗采用293T細胞作宿主，因為293T細胞是常用的宿主細胞，容易培養。pcDNA3.1pcDNATM 3.1/myc-His（-）A為真核表達載體（pcDNA）含有T-7啟動子，并且具有表達標簽Myc和His，便于鑒定和純化，高效表達重組融合蛋白。本試驗將CYP27B1在293T細胞成功表達，并且具有羥化25（OH）D3生成1α，25-雙羥基維生素D3的能力，為進一步研究CYP27B1表達量對細胞增殖和凋亡的影響提供參考。

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