酶聯免疫測定中出現非特異性反應的原因及探討

摘要：目的 對醫學酶聯免疫測定中所出現的非特異性反應原因進行分析和探討，并對其應對措施進行了總結和討論。方法 選取2014年1月～2015年1月這一時間段內所應用的酶聯免疫測定為研究對象，并對其所出現的非特異性反應進行了調查和原因分析。結果 在所調查的20000例酶聯免疫測定實驗中，其中出現非特異性反應的有7340例，非特異性反應發生率為36.7%；結論 由于各種酶聯免疫吸附試驗之所以會出現一系列的非特異性反應，原因就在于所應用的試劑盒在質量方面有著一定的區別、被測物體中的各項因素，如外源性因素和內源性因素，兩大影響因素對實驗結果的準確性有著重要的意義；應對措施：加強檢驗工作人員的專業技能及業務操作能力、責任意識也就顯得尤為重要，在檢測過程中盡量的減少在加樣、洗板、結果判斷等過程中的人為誤操作而造成的誤差，從而有效確保將酶聯免疫測定中的非特異性反應的影響降到最低，從而實現測定結果的準確性和可靠性，同時也確保了血液質量的安全。

關鍵詞：酶聯免疫；非特異性反應；原因分析；探討

Abstract：Objective The reasons of nonspecific reaction in the enzyme immunoassay were analyzed and discussed， and the countermeasures were summarized and discussed.Methods The enzyme linked immunosorbent assay was used in the period of ～2015 in January， January 2014， and the non-specific reaction was investigated and analyzed.Results In the 20000 cases of enzyme linked immunosorbent assay， there were 7340 cases of nonspecific reactions， and the incidence rate was 36.7%.Conclusion Due to the variety of enzyme linked immunosorbent assay has a nonspecific response to a series of， the reason lies in the kit which is applied to a certain difference， the factors measured in the object in terms of quality， such as exogenous and endogenous factors， plays an important role in the accuracy of two major influence factors on the experimental results countermeasures： strengthen inspection； staff awareness of professional skills and operation ability， responsibility is particularly important， the error in the detection process as much as possible to reduce human errors in the sample， washing plate， etc. in the process of judging the results caused by， so as to effectively ensure that will affect the nonspecific reaction enzyme-linked immunosorbent assay the lowest， in order to achieve the accuracy and reliability of test results， but also to ensure that the quality of blood safety..

Key words：Enzyme linked immunosorbent assay； Nonspecific reaction； Cause analysis； Studyc

自上世紀70年代酶聯免疫吸附試驗問世以來，憑借其特異性強、使用安全以及較高的敏感性和簡便的操作等優勢特點被廣泛的應用到現代臨床醫療診斷過程中，并且作為了臨床的一種主要的免疫診斷方法，但由于技術上的欠缺不足，使得其在具體應用實踐過程中也暴露出了一定的問題，如非特異性問題的出現，基于此，本文針對酶聯免疫測定中所出現的非特異性反應的具體原因機制進行了分析和討論。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本站2014年1月～2015年1月這段時間的無償獻血者標本20000人份，均符合國家規定的獻血者體格檢查標準，以此為標準進行酶聯免疫反應測定，其中共有7340例出現了特異性反應，發生率達36.7%。

1.2試劑與儀器 所用試劑盒是中國生物檢定所檢定合格的試劑；所用儀器由澳斯幫公司每年定期檢定的：STAR全自動加樣儀和FAME全自動酶聯免疫檢測系統。

1.3方法 通過回顧性調查分析的方法，并對相關數據進行整理和收集，同時與專業工作人員進行及時溝通。

2 結果

在所調查的20000例酶聯免疫測定實驗中，其中出現非特異性反應的有7340例，非特異性反應發生率為36.7%。

3 討論

3.1試劑盒特異性的影響因素及應對方法分析

3.1.1固相載體的選擇 微孔板作為酶聯免疫測定中應用最為廣泛的固相載體，這些載體（除了膜片外）在多數情況下所應用的也都是聚苯乙烯，其中聚苯乙烯平地微孔板就是一種最為常見的固相載體，該載體具備了優異的蛋白吸附能力，也兼具了良好的透光性，但同時需要指出的是，該載體對于蛋白的吸附現象屬于一種疏水性的物理吸附現象，該載體并能夠將各類別的蛋白同時吸附到其表面，所以，這也就導致了在酶聯免疫測定中的任何一個操作環節都有可能出現非特異性反應，對于出現的非特異性反應在操作過程中也都是需要采取一定的加以防止的。

現階段，醫療領域微孔板的種類數目繁多，不同的類型都有著不同的性質，因此，在酶聯免疫測定實驗的進行過程中，微孔板的選擇就顯得尤為重要。首先，對于一個全新的系統在進行微孔板的選擇過程中，前期必要要進行科學的評估和認證，從而選擇出最佳的型號和類別；在微孔板的生產上架和具體型號確定之后，在真正使用之前還需要對微孔板進行吸附能力測定實驗，在達到規定要求標準后方可投入使用。

3.1.2包被抗體同酶標抗體的配伍以及相應的抗體效價 在酶聯免疫測定過程中的所應用的雙抗體夾心法，如果一旦出現了不合理的酶標抗體與包被抗體的配伍現象，將會直接導致包被抗體與酶標抗體同各種雜質的相錯認，最終導致非特異性反應的出現。對于測定試劑特異性的決定方面，抗體的效價發揮了極具重要的作用；相比較于低效價的抗體，高效價的抗體的特異性一般有著明顯的優勢。因為對于高效價的抗體，具有了較高的濃度，同時其稀釋度也是比較大的，在高效價的抗體中含有較少的雜質，能夠有效地減少和降低非特異性吸附能力。因此，在試劑的開發研制階段，對于單抗以及多抗的篩選工作必須要投入足夠的精力和時間。

3.1.3封閉操作 在酶聯免疫測定法中，封閉操作作為一項重要的步驟，其目的就是為了將在固相載體上所留下的空白暴露位點實施封閉，以達到有效減少后續操作中的非特異性蛋白的干擾，在操作過程中所應用的封閉試劑一般也都是一些惰性物質（如小牛血清、明膠和牛血清血白蛋白等）；在封閉操作之后，如果在微孔板中仍然存在著暴露位點，那么就會直接將在后續操作步驟中的非特異性蛋白直接吸附到微孔板上，實現與酶標的相結合，因而產生非特異性反應；另外，也可能是將酶標抗體直接的吸附到微孔板上而而出現顯色反應，所以如何選擇最為合適的封閉試劑就成為了一關鍵性步驟；一般情況下，封閉試劑的選擇都是結合著系統的具體特點來進行，從而確定所選試劑的科學性和合理性。在判斷所選試劑是否與系統相符時，功能性試驗就成為了一主要的確定方法。

3.2檢測標本中是否含有酶標記物的干擾物

3.2.1內源性干擾物 檢測標本中的內源性干擾物主要包括了類風濕因子、嗜異性抗體以及黃疽等；其中類風濕性因子屬于一種能夠同時作用于人和動物的抗體，其多為1GM類，并能夠充當抗原成分與固相酶標抗體進行反應，從而出現非特異性反應；應對措施就是制備一FAB段抗體，成功的將抗體與類風濕因子之間的連接切斷。而在黃疽血標本中通常都會含有一些內源性的過氧化物酶，當選用辣根過氧化物酶為標記物時，非特異性反應出現的可能性也就會極具增加；在人類的血清中存在著能夠與嚙齒類動物相結合的天然型嗜異性抗體，當檢測系統所應用的是鼠源性單抗體時，嗜異性抗體就會很容易的與之結合，從而形成一種假陽性，出現非特異性反應，具體應對方法就是在所用的樣品稀釋液和酶標稀釋液中添加適量的增長鼠血清，從而能夠很好的中和嗜異性抗體。

3.2.2外源性干擾物 外源性干擾物主要包括了樣本的不合理采集、貯存以及處理等操作，比如細菌的污染、樣本的溶血、采血人員在給獻血員采集血液的過程中由于選擇血管不正確致血流不暢；采集完的血液在標本留取過程中混勻不均致標本抗凝不充分，纖維蛋白析出以及標本處理時離心時間、離心力達不到等多項因素。

3.3實驗過程中具體問題導致假陽性的出現

3.3.1洗滌 在酶聯免疫測定過程中，為實現測定結果的可重復性，正確的洗滌作為了重要的第一步。對于洗滌過程不管是手工操作還是儀器操作，其所得結果的準確性都與正確的洗滌操作有著緊密的聯系?，F階段比較常用的兩種洗滌方法主要有：其一，增加浸泡時間，減少洗滌次數；其二就是多次快速的洗滌過程，增加洗滌次數而減少侵泡時間；上述兩種洗滌方法均能得到令人滿意的效果。

3.3.2移液器的精度不夠 對于酶聯免疫檢測法，測定標本前期都是需要進行一定的稀釋過程，這一過程中如果移液器的精度不夠，那么就很有可能出現誤差，特別是在稀釋數倍的操作中，即使是存在著很小的絕對誤差，那么也將會導致后期出現很大的相對誤差，從而引發非特異性反應。所以為確保測定結果的可靠性與準確性，移液器的精度有著重要作用，因此，加大對移液器的保養工作就顯得尤為重要。目前，本站使用的是全自動酶免儀處理標本，可較好地避免以上誤差。

3.3.3操作不合理、失誤 對于過程中所應用到的每一種試劑，都有一種最佳的反應模式，為確保所得結果的準確性及可靠性，對相關試劑的操作就要嚴格按照相關說明進行，科學的控制溫度和溫育時間是執行環節中重要內容；如果孵育溫度過高或反應時間過長，都將導致整板本出現過高的陽性率及較高的本底，進而影響檢測結果的準確性。

4 結語

目前由于相關技術條件上的制約，使得酶聯免疫吸附法在技術上層面還無法達到一種標準化，對應的在測定過程中也會不可避免的出現一定的非特異性反應；經過上述原因分析，我們了解到，對于各項原因下出現的特異性反應需要采取一定的應對措施，進而能夠最大限度的將非特異性顯色反應的影響降到最低，從而實現檢測結果準確性、可靠性的有效提高。

參考文獻：

[1]張斌.酶聯免疫（ELISA）法中出現非特異性顯色的原因及探討研究[J].中外醫療，2009，01：146.

[2]張建偉.ELISA法中出現非特異性顯色原因分析[J].臨床輸血與檢驗，2005，01：37-38.

[3]蔡俊杰，張彥，陳源.免疫組織化學反應后出現真假非特異性顯色原因的探討[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2002，03：350-351.

[4]謝毅，宋琳，喻方敏，等.ELISA檢測HBsAg的非特異反應因素分析[J].洛陽醫專學報，2002，03：185-187.