EGFR基因對晚期非小細胞肺癌治療方案選擇影響的研究

摘要：目的 晚期非小細胞肺癌（NSCLC）在經過一線治療后，常在一個短暫的緩解期后發生復發或轉移，絕大多數患者需要二、三線治療。目前指南僅指出一線治療方案需根據患者EGFR基因狀態決定靶向治療或化療，二、三線治療方案的選擇尚無明確線索。本研究旨在檢測化療前后晚期NSCLC患者EGFR基因狀況，為晚期NSCLC臨床治療方案的制定提供理論依據。方法 收集并提取40例2014年8月1日～2015年6月1日就診于石河子大學第一附屬醫院，接受以鉑類為基礎化療的晚期肺腺癌患者外周血DNA，采用PCR及直接測序法檢測EGFR基因19及21外顯子突變情況，應用SPSS軟件進行統計學分析。結果 40例入組患者中38例實驗成功，其中化療前EGFR基因突變者17例（44.7%），化療后EGFR基因突變者19例（50%），化療前后基因突變狀態一致者26例（68.4%），不一致的12例患者中，5例患者由陽性轉為陰性，7例患者由陰性轉為陽性。結論 ①化療可能導致肺腺癌患者外周血EGFR基因狀態改變。②初診EGFR基因為野生型患者化療后應行EGFR基因檢測指導靶向治療。

關鍵詞：非小細胞肺癌；人表皮生長因子受體；化療；靶向治療

肺癌是當今世界上發病率及死亡率最高的惡性腫瘤。世界衛生組織（WHO）2014年11月公布的資料表明，2012年全球肺癌新發病例180萬人次，死亡人數159萬人次，在所有惡性腫瘤中其發病率（16.7%）和病死率（19.4%）均居首位[1]。肺癌早期缺乏特異性臨床表現，約70%患者確診時已屬晚期，失去手術治療機會，僅適合以化療為主的治療。最新NCCN指南中指出，初診的非小細胞肺癌（NSCLC）患者應行EGFR基因檢測，對于EGFR基因敏感型突變的患者，一線治療首選人表皮生長因子酪氨酸酶抑制劑（EGFR-TKIs）靶向治療，對于EGFR基因野生型及耐藥型突變的患者首選化療。但大部分患者接受一線治療后，疾病會在一個較短的緩解期后發生復發或轉移，對于二、三線治療方案的選擇，指南中推薦化療或靶向治療，但方案選擇的具體依據并未給出。一些早期的研究表明[2]，EGFR-TKIs與安慰劑對比，可明顯延長患者生存期并減輕患者臨床癥狀。TITAN及IPASS[3-4]實驗表明，晚期NSCLC患者二線使用EGFR-TKIs與標準化療相對比，患者總生存期（OS）與無進展生存期（PFS）并無顯著差異，但在藥物毒副反應方面存在明顯優勢。因此有學者認為[5]，對于EGFR敏感突變的患者，EGFR-TKIs在一線或二、三線治療均能獲益，故EGFR-TKIs的使用時機仍有待研究。但有研究表明，對于EGFR基因敏感突變的患者，EGFR-TKIs作為一線方案或二線方案治療的臨床緩解率不盡相同，但其機制尚不明確[1，6-8]。在臨床中，我們觀察到部分EGFR基因野生型患者在化療后使用EGFR-TKIs有顯著療效。因此我們推測患者腫瘤基因的EGFR表型并不穩定，是隨著疾病的進展及治療發生著改變，EGFR基因的監測對NSCLC的治療可能具有指導意義。目前臨床主要使用組織穿刺活檢進行EGFR基因檢測，該方法對患者創傷大，臨床難以實現重復取材，無法動態監測患者EGFR基因。隨著分子生物學發展，大樣本的研究[9-10]提示，腫瘤患者外周血游離DNA含量明顯上升，且大部分為腫瘤組織所釋放，其EGFR基因檢測與組織相比一致性好，約為79.7%～94%。該方法為實現動態監測患者EGFR基因狀態提供了可能。本研究通過監測NSCLC患者化療前后外周血游離DNA EGFR基因狀態，為臨床治療方案的制定提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2014年8月1日～2015年6月1日就診于石河子大學第一附屬醫院的晚期肺腺癌患者，共計40例。入組標準：①入組患者均經組織學或細胞學確診為非小細胞肺腺癌，且已行組織病理學EGFR基因檢測（ARMs法）；②臨床分期ⅢB～Ⅳ期；③年齡≥20歲；④ECOG功能狀態評分0～2分，具有可測量病灶；⑤重要臟器功能基本正常；⑥患者自愿接受以順鉑為基礎的化療方案，并能夠依從研究和隨訪研究。所有入組患者均已簽署知情同意書，本研究已通過石河子大學醫學院第一附屬醫院倫理委員會審核。

1.2方法 入組患者給予以鉑類為基礎的化療，所有患者治療前一天水化處理減輕化療反應，化療當日給予止吐處理。每2周期復查肺部CT，依據RECIST 1.1實體瘤療效評價標準評估療效，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩定（SD）、疾病進展（PD）。

1.3主要儀器與試劑 研究所用儀器（包括低溫離心機、NanoDrop DNA濃度測試儀、PCR儀、凝膠圖像成像儀等）主要由新疆石河子大學醫學院《新疆地方與民族高發病》教育部重點實驗室提供。使用德國Qiagen公司的QIAampBloodMinKit試劑盒進行樣本DNA提取。

1.4樣本采集 采集患者靜脈血5 ml，2 h內提取血清，3000 r/min，離心10 min（r=18 cm），取上層血清-80℃保存。

1.5 DNA提取及質控 按QIAampBloodMinKit試劑盒說明書提取樣本DNA，利用NanoDrop檢測樣本DNA的濃度和純度，A260/A280值為1.6～2.2，DNA濃度2.4～27.6 ng/μl，-80℃保存。

1.6 PCR擴增及基因測序 根據GenBank數據庫檢索得到人EGFR基因序列，設計EGFR外顯子19和21的引物，經NCBIBLAST同源性檢索后，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見表1。PCR體系含DNA模板4 μL，PCR mix 25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，無酶水17 μL，總體積50 μL。PCR循環：95℃預變性5 min；進入循環擴增階段，95攝氏度變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45s，此階段共35個循環；最后72℃保溫15 min。基因測序：取5 μL PCR產物與1 μL Loading Buffer混勻，經2%瓊脂糖凝膠92 V電泳40 min后，用紫外光透視儀分析圖像并照相。最終PCR產物送北京華大基因完成測序，使用CHROMAS軟件進行閱讀。

1.7 EGFR基因外顯子19和21片段突變結果判讀 EGFR基因19外顯子突變為缺失突變，測序結果行NCBIBLAST與野生序列進行對比，若測得序列與野生型序列吻合且無套疊樣峰圖，判讀為野生型，見圖1；若表現為一段序列缺失或為野生型與突變型套疊樣峰圖，判讀為突變型，見圖2、圖3。EGFR 基因21外顯子突變為L858R突變，若所測得結果與野生型序列吻合且無套疊樣峰圖，判讀為野生型，見圖4；若為單一T/G突變或表現為T/G套疊樣峰圖，判讀為突變型，見圖5。EGFR 19外顯子及21外顯子突變均為EGFR-TKIs敏感突變，見表1。

1.8 統計學分析 使用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，使用Kappa評分分析組織與血清EGFR突變一致性，使用χ2檢驗分析患者化療前后EGFR基因突變的差異及EGFR基因突變與臨床療效的關系，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1患者臨床特征 入組40例患者中38例患者試驗成功，失訪1例，DNA提取失敗1例。38例患者中男性患者25例，女性患者13例；年齡47～74歲，中位年齡60歲。有吸煙史者20例，不吸煙者18例（不吸煙為不吸煙或每年吸煙<20支）。

2.2患者化療前組織EGFR基因狀態 化療前患者組織EGFR基因敏感突變率為44.7%（17/38），其中19外顯子突變6例，突變率15.8%（6/38），21外顯子突變11例，突變率29.0%（11/38），可見以21外顯子突變為主64.7%（11/17）。其中男性患者EGFR基因突變率36.0%（9/25），女性患者EGFR基因突變率61.5（8/13），女性高于男性，但差異無統計學意義（χ2=2.189，P=0.139）。吸煙患者EGFR基因突變率為20.0%（4/20），不吸煙患者EGFR基因突變率為72.2%（13/18），EGFR基因突變概率不吸煙患者大于吸煙患者，差異顯著（χ2=7.01，P=0.008）。

2.3患者化療前血清與組織EGFR突變狀態比較 化療前患者組織EGFR基因敏感突變檢出17例（44.74%），血清EGFR基因敏感突變檢出13例（34.3%），血清與組織EGFR檢測結果行一致性檢驗，假陽性率0%，假陰性率16%，特異度100%，靈敏度84%，Kappa值為0.782（Kappa>0.75），可得結論：血清與組織兩種樣本EGFR基因檢驗一致性較好。

2.4患者化療前后血清EGFR基因突變狀態比較 患者化療后血清EGFR基因突變發生率為50%（19/38），其中19外顯子突變13.2%（5/38），21外顯子突變36.8%（14/38），仍以21外顯子突變為主73.7%（14/19）。其中化療前后均為陽性患者12例，化療前后均為陰性患者14例，突變一致率為68.4%（26/38）；5例患者由陽性轉為陰性，7例患者由陰性轉為陽性，但化療前后EGFR基因突變總體差異無統計學意義（χ2=3.60，P=0.165）。

2.5患者EGFR基因突變狀態與化療療效的關系 38例患者均接受以鉑類為基礎的化療，其中CR 0例，PR 6例（15.8%），SD 21例（55.3%），PD 11例（28.9%），疾病控制率71.1%（27/38）。其中EGFR突變陽性患者（以組織學為準）疾病控制率為88.2%（15/17），EGFR陰性患者疾病控制率為57.1%（12/21），差異顯著（χ2值無，P=0.01）。化療療效與患者EGFR基因變化情況行單因素logistic回歸分析，回歸系數為0.465，P=0.227，OR=1.592（0.748-3.387）。可得結論：①以鉑類為基礎的一線化療對EGFR基因突變陽性患者的療效優于EGFR基因突變陰性的患者。②化療療效與化療前后EGFR基因狀態改變與否無關。

3 討論

本研究前瞻性的監測了接受化療的晚期NSCLC患者EGFR基因狀態的改變，且使用血清提取外周血游離DNA，有效的排除了血液標本中有核細胞對試驗結果的影響。研究觀察到部分患者的EGFR基因狀態在治療的過程中發生了改變。由于設置安慰劑組對照有悖于倫理，尚不能確定產生該現象產生的原因是由于化療或是疾病的自然進程。但有研究表明[11]，對EGFR 19外顯子突變的NSCLC細胞系進行鉑類耐藥處理的同時，該細胞對EGFR-TKIs的敏感性降低。亦有研究表明[12]，部分患者原發灶與轉移灶的EGFR基因狀態并不一致。因此，我們可以推測，造成患者EGFR基因檢測結果變化的原因是多元化的。

NCCN指南指出一線治療時應先行EGFR基因檢測，對于初診EGFR基因敏感突變的患者首選EGFR-TKIs。本試驗結果亦表明EGFR-TKIs應作為一線治療。雖然研究結果顯示對于EGFR基因敏感突變的患者，EGFR-TKIs與化療效果均優于EGFR基因野生型患者，但化療毒副反應重，對患者損傷較重，且部分患者會因發生EGFR基因表型的改變，導致該患者錯失使用EGFR-TKIs的機會。對于初診EGFR基因野生型的患者，也并非徹底喪失了EGFR-TKIs的使用機會。研究結果顯示，仍有小部分患者在經歷了化療之后EGFR基因由野生型向敏感型轉變，并且該轉變與化療的療效并沒有明顯聯系。由此可見，一、二線化療失敗后再次進行EGFR基因檢測是有必要的，對于再次檢測發現突變的患者，二、三線治療選擇EGFR-TKIs不失為一個明智的選擇。

本研究顯示，晚期NSCLC患者在疾病的發生、發展及治療的過程中，其EGFR基因狀態隨時可能發生改變，但本試驗仍存在可改進之處。首先，本研究樣本量小不可避免的會產生誤差，尚需要多中心、大樣本量的研究來驗證我們的試驗結論。另外，本研究因臨床二次組織取材困難，未能獲得患者化療后腫瘤組織，目前由于技術限制，血液學標本EGFR基因檢測較組織標本假陰性率高，有待有條件的中心進步一證實本研究結論，獲得更加強有力的證據，為晚期NSCLC患者的治療提供新的思路。

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編輯/翟辰萬