漢防己甲素對鈦顆粒刺激PBMC表達HMGB1的研究

摘要：目的 探討漢防己甲素對鈦顆粒刺激人血單個核細胞（PBMC）釋放HMGB1的影響，為臨床提供防治人工膝關節無菌松動提供證據。方法 將按照密度梯度方法提純人血單個核細胞分為四組，1組為陰性對照組：不做任何處理；2組為陽性對照組：PBMC+0.1%鈦顆粒；3組為低濃度漢防己甲素組：PBMC+0.1%鈦顆粒+漢防己甲素1g/ml；4組為高濃度漢防己甲素組：PBMC+0.1%鈦顆粒+漢防己甲素10 g/ml；培養48h后，應用ELISA和RT-PCR方法分別檢測上清液中HMGB1濃度和人血單個核細胞中HMGB1mRNA的表達情況。統計學采用SPSS軟件分析a=0.05為檢驗水準。結果 ①鈦顆粒刺激PBMC表達HMGB1蛋白及HMGB1mRNA含量明顯升高：1、2組HMGB1蛋白含量分別為16.34 1.63ng/ml、63.13 2.73ng/ml，兩者比較有統計學意義（F=2600.42，P<0.01）；HMGB1mRN含量分別為0.19 0.03、0.78 0.07，有統計學意義（F=516.55，P<0.01）；②漢防己甲素對受鈦顆粒刺激后單核細胞釋放HMGB1及HMGB1mRNA含量的影響：3、4兩組與2組釋放HMGB1存在統計學差異（F=600.57，2621.29，P<0.01），HMGB1mRNA含量（F=250.18，288.59，P<0.01）；與1組比較有統計學差異（F=2153.03，1177.804，P<0.01）HMGB1mRNA含量（F=276.39，184.62，P<0.01）。結論 人工關節假體磨損顆粒可通過上調單核細胞HMGB1mRNA的表達及HMGB1的釋放，促進假體周圍炎癥反應，導致假體無菌性松動；防漢己甲素通過抑制單核細胞HMGB1的釋放及合成可能防治人工關節無菌松動。

關鍵詞：漢防己甲素；鈦顆粒；單個核細胞；高遷移率族蛋白-1

Study on the Expression of HMGB1 in PBMC Stimulated by Tetrandrine on Titanium Particles

ZHAO Li，MA Xing-juan，ZHAO Jing

（The First Hospital of Handan，Handan 056002，Hebei，China）

Abstract：Objective The release of HMGB1 of Tetrandrine n on titanium particles stimulate blood mononuclear cell （PBMC） was approached，to supply documentation for prevention artificial knee joint aseptic loosening. Methods The cells were divided into 4 groups ，cells in group 1 were added with nothing， while cells in group 2，3，and 4 were added with titanium particles（0.1%），and the cells in group 3，4 were added with Tetrandrine （1 g/ml，10 g/ml）.The contents of HMGB1 protein and HMGB1Mrna of the 4 groups were respectively detected through enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）and polymerase chain reaction（PCR） after culturing for 48 hours. Results ①Effect of titanium particles suspension concentration on HMGB1expression： There were statistical differences in the contents of HMGB1 protein and HMGB1 m RNA of macrophages among the 2 groups（F=2600.42，P<0.01； F=516.55，P<0.01）.② Effect of titanium particles and Tetrandrine on the expression of HMGB1 protein and HMGB1 m RNA ： There were statistical differences in the contents of HMGB1 protein and HMGB1 m RNA of macrophages among the 2 group and 3/4 group（F=17.73，P<0.01； F=723.45，P<0.01）； There were statistical differences among the 1 group and 3/4 group（F=2153.03，P<0.01； F=1177.804，P<0.01）.Conclusion Wear particles from joint prosthesis can up-regulate the expression of HMGB1 ，which leads to bone absorption and osteolysis. Tetrandrine could realsed the expression of HMGB1， which would be used to patients for prevention artificial knee joint aseptic loosening.

Key words：Tetrandrine；titanium particles；PBMC；HMGB1

人工關節假體磨損顆粒誘導的慢性炎癥反應可促進假體周圍骨吸收、溶解，是人工關節置換術后假體無菌性松動的主要原因之一[1]。高遷移率族蛋白1（high mobility group protein，HMGB1）可以啟動天然免疫和獲得性免疫應答，參與膿毒癥、關節炎等多種疾病過程，但HMGB1與人工關節松動的關系，尚無明確研究結果。漢防己甲素又稱粉防己堿，是從中藥漢防己的根塊中提取的一種生物堿，其可通過抑制T淋巴細胞及單核巨噬細胞等免疫炎癥細胞的增殖和激活從而抑制炎癥反應，有研究發現漢防己甲素明顯抑制關節炎的發展且作用強于阿司匹林[2]，但漢防己甲素是否通過抑制HMGB1的合成和釋放以抑制假體松動時的無菌性炎癥反應，目前尚無研究。本研究通過鈦顆粒刺激單個核細胞模仿人工關節局部環境為研究對象，探討漢防己甲素對鈦顆粒刺激單個核細胞HMGB1釋放和合成的影響。

1 材料與方法

1.1材料 采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC）。淋巴細胞分離液，10%小牛血清RPMI1640，Hank s液，鈦顆粒（Alfa Aesar公司），HMGB1酶聯免疫吸附劑測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）、Trizol Reagent總RNA提取試劑（北京德博生物有限公司），漢防己甲素（臨汾藥業有限公司）。

1.2實驗儀器 DHC-1300-RA-BR超凈工作臺（蘇州凈化公司），PCR儀（BD公司）。

1.3方法

1.3.1細胞分離及活力檢測 將采用 Ficoll密度梯度離心法獲得的外周血單個核細胞加入5倍以上體積的Hank s液，1500rpm×10min，洗滌細胞兩次，末次離心后，棄上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640，重懸細胞，取一滴細胞懸液與一滴0.2%臺盼藍染液混合，于血球計數板上，計數四個大方格內的細胞總數計細胞活力檢測，活細胞百分率在95%以上。

1.3.2鈦顆粒懸液配制 將鈦顆粒用乙醇浸泡消毒后，用無菌PBS配成濃度為0.1%的懸液，用鱟試劑證實無內毒素后儲存在4℃冰箱備用。

1.3.3外周血單個核細胞的HMGB1的RT-PCR檢測 嚴格按照說明書提取外周血單個核細胞的DNA，由上海生工合成HMGB1的引物及管家基因Actin的引物。HMGB1的上游引物：5 -AGATC CTAAG AAGCC GAGAG-3，下游引物：5-GGCTG ACAAG GCTCG TTATG-3。管家基因Actin引物序列：上游引物5-CCCAG AGCAA GAGAGGCATCC-3，下游引物5-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3。反應條件：42℃1h后，95℃熱變性5min，RT反應后得到產物長度為269bp，應用photoshop7軟件檢測HMGB1mRNA的條帶強度多為表達數值。

1.4觀察指標

1.4.1鈦顆粒對HMGB1表達的影響 將細胞分為兩組，1組不做任何處理，2組加入濃度為0.1%的鈦顆粒，培養48h后采用ELISA和RT-PCR方法檢測兩組的HMGB1蛋白和HMGB1mRNA的含量。

1.4.2不同濃度漢防己甲素對鈦顆粒刺激PBMC表達HMGB1的影響 將加入濃度為0.1%鈦顆粒的細胞分為兩組，3組加入漢防己甲素1g/ml，4組加入漢防己甲素10g/ml，培養48h后采用ELISA和RT-PCR方法檢測兩組的HMGB1蛋白和HMGB1mRNA的含量。

1.5統計學方法 采用SPSS13.0軟件對所得數據進行統計分析，1～6組外周血單個核細胞HMGB1及HMGB1mRNA含量的組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準a=0.05。

2 結果

2.1鈦顆粒對HMGB1表達的影響 1組和2組單個核細胞HMGB1蛋白和HMGB1mRNA含量的組間比較均有統計學差異。兩組HMGB1蛋白含量比較（F=2600.42，P<0.01）；兩組HMGB1mRNA含量比較（F=516.55，P<0.01）.

2.2不同濃度漢防己甲素對鈦顆粒刺激PBMC表達HMGB1的影響 加入不同濃度漢防己甲素兩組（3、4組）和鈦顆粒組（2組）刺激PBMC表達的HMGB1及HMGB1mRNA含量的比較均有統計學差異。其中HMGB1含量的比較：3、4組的表達均低于2組（F***=600.57，F****=2621.29，P<0.01）；3、4兩組表達高于1組（F*=100.31， F**=15.88，P<0.01）。HMGB1mRNA含量：3、4組表達低于2組（F***=250.18， F****=288.59，P<0.01）； 3、4組高于1組（F*=276.39， F**=184.62，P<0.01）；3組HMGB1蛋白及HMGB1mRNA含量均高于4組（FHMGB1=69.64，P<0.01； FHMGB1m RNA=6.05，0.01

3 討論

人工關節置換術是治療包括髖、膝、肩、肘、踝關節等嚴重關節疾病的有效手段，但假體磨損、松動、甚至斷裂等并發癥現在已成為抑制關節置換術發展的瓶頸。調查發現人工關節假體松動居于并發癥的首位[3]，人工關節假體磨損顆粒誘導的慢性炎癥反應可促進假體周圍骨吸收、溶解，是人工關節置換術后假體無菌性松動的主要原因之一。目前體外實驗研究常選用鈦顆粒作為假體磨損顆粒來研究[4]。

細胞外的HMGB1是重要的致炎介質，作為組織損傷信號[5]，刺激單核巨噬細胞、樹突狀細胞的活化和增殖，誘導這些免疫炎癥細胞釋放多種炎性因子[6]。本研究顯示，鈦顆粒刺激人單個核細胞后，上清液中檢測HMGB1蛋白含量增加（F=2600.42，P<0.01），單個核細胞中HMGB1mRNA表達增加（F=516.55，P<0.01），證實鈦顆粒可通過刺激單個核細胞合成和釋放HMGB1引起炎性因子釋放。

漢防己甲素又稱粉防己堿，是從中藥漢防己的根塊中提取的一種生物堿，具有消炎、鎮痛、降壓、降血糖、調節免疫功能、抑制炎癥反應和抗自由基損傷等多種藥理作用，臨床常用在抗肝纖維化和抗腫瘤等方面。本研究也顯示通過將不同濃度的漢防己甲素加入鈦顆粒刺激的人單個核細胞中，發現漢防己甲素均可抑制HMGB1的釋放和合成（F***=600.57，F****=2621.29，P<0.01），且這種抑制作用具有劑量依賴性（FHMGB1=69.64，P<0.01；FHMGB1m RNA=6.05，0.01

HMGB1作為一種炎癥介質和致炎細胞因子，已成為近年危重醫學研究的熱點之一。因其為啟動和維持炎癥級聯放大效應的中心分子，具有較寬的治療窗口，是目前抗炎治療的靶向目標。本研究顯示漢防己甲素作為具有抑制炎癥反應的中藥，可明顯抑制鈦顆粒刺激人單個核細胞合成和釋放HMGB1，從而抑制鈦顆粒刺激引起的炎癥反應，因此漢防己甲素在防治關節假體松動等慢性炎癥疾病方面具有遠大的前景。

參考文獻：

[1]Atkins GJ，Haynes DR， Howie DW， et al. Role of polyethylene particles in peri-prosthetic osteolysis： A review[J]. World J Orthop，2011，2（10）：93-101.

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[3]Noble PC. Bkm-eehanieal Advances in Total Hip Replacement in Biomechanical in Orthopaedics（eds NiwaPe-en SM. Attori T）[J].Tokyo Japan Sptingerverlag.1992，46-75.

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[7]曹金，楊兆文，李鳳，等.漢防己甲素的臨床應用進展[J].醫藥專論，2013，34（2）：75-79.

編輯/成森