復(fù)方豨薟草膠囊對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜細胞核因子—κB表達的影響

摘要：目的 通過觀察復(fù)方豨薟草膠囊對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜細胞核因子-κB的影響，探討其抗炎鎮(zhèn)痛作用機制。方法 60 只大鼠隨機分成正常對照組15只，模型組15只，復(fù)方豨薟草膠囊組15只，痛風(fēng)寧膠囊組15只。分別給予生理鹽水氯化鈉溶液、復(fù)方豨薟草膠囊藥液、痛風(fēng)寧膠囊藥液灌胃3 d，第4 d建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，造模后5 h 切取踝關(guān)節(jié)滑膜，免疫組化法觀察滑膜細胞核因子-κB的表達。結(jié)果 造模后受試關(guān)節(jié)滑膜細胞核因子-κB表達都有顯著增強。復(fù)方豨薟草膠囊與痛風(fēng)寧膠囊均可下調(diào)核因子-κB的表達，二者間無顯著性差異。結(jié)論 復(fù)方豨薟草膠囊通過下調(diào)核因子-κB的表達，來發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用。

關(guān)鍵詞：復(fù)方豨薟草膠囊；痛風(fēng)；滑膜；核因子-κB

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（GA）是體內(nèi)嘌呤代謝紊亂進而使尿酸鹽結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)和周圍組織引起的一種常見的代謝性疾病，是21世紀(jì)對人類健康最具挑戰(zhàn)的幾個問題之一。近些年來，我們采用經(jīng)驗方復(fù)方豨薟草膠囊治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎取得滿意效果，具有抗炎鎮(zhèn)痛作用快、藥效強、副作用小等優(yōu)點。為闡明其抗炎鎮(zhèn)痛作用機制，本實驗通過構(gòu)建急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察其關(guān)節(jié)滑膜細胞核因子κB的表達，探討復(fù)方豨薟草膠囊的干預(yù)機制。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1 實驗動物 雄性Wistar 大鼠60只，清潔級，由江西中醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供并飼養(yǎng) （許可證書：SYXK，贛，2004-0001）。精確稱重，體重（200±20）g。購買后適應(yīng)性常規(guī)喂養(yǎng)3 d，溫度約（20±3）℃，濕度60%，明暗周期12 h/12 h，每籠喂養(yǎng)10只實驗動物，通風(fēng)，自由飲水進食，普通飼料喂養(yǎng)。

1.1.2實驗藥物 復(fù)方豨薟草膠囊由豨薟草、蒼術(shù)、土獲苓、秦艽、威靈仙、金錢草、丹參、漢防己等藥組成，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，將囊內(nèi)研粉加蒸餾水溶解配制2%懸浮液。痛風(fēng)定膠囊由成都中匯制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z10970025，將囊內(nèi)研粉加蒸餾水溶解配制2 %懸浮液。

1.1.3主要試劑 大鼠核因子-κB單抗試劑盒（美國Cayman 公司）。

1.2方法

1.2.1急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物模型制作方法 參照Coderre等經(jīng)典方法[1-2]并作改進，即用試敏注射器在受試大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)從450方向插入脛骨肌腱內(nèi)側(cè)，將0.2 ml尿酸鈉溶液（濃度2.5 g/100 ml）注入到踝關(guān)節(jié)腔，構(gòu)建急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。

1.2.2尿酸鈉結(jié)晶及尿酸鈉溶液的制備 194 ml蒸餾水加NaOH（1 mol/L）6 ml，煮沸，加1 g尿酸，用HCl（1 mol/L）調(diào)pH至7.2，攪拌冷卻，4℃冰箱保存24 h，去上清，用濾紙將沉淀物水分吸干，放入70℃干燥箱烘2 h，取出，刮下粉末，研缽內(nèi)研成細末，用孔徑250 μm的金屬篩過篩，制成尿酸鈉結(jié)晶，取250 mg尿酸鈉結(jié)晶加9 ml生理鹽水，再加1 ml吐溫80，加熱攪拌，配制成10 ml尿酸鈉溶液。

1.2.3動物造模及分組 根據(jù)實驗設(shè)計要求將實驗大鼠隨機分成正常對照組15只，模型組15只，復(fù)方豨薟草膠囊組15只，痛風(fēng)定組15只。復(fù)方豨薟草膠囊組與痛風(fēng)定組分別予復(fù)方豨薟草膠囊藥液和痛風(fēng)定懸浮液3 ml灌胃，正常對照組與模型組等容量生理氯化鈉溶液水灌胃，2次/d，連續(xù)3 d。各組第4 d 第1次灌胃后1 h造模。正常對照組右踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.2 ml 生理鹽水，其余各組注射0.2 ml尿酸鈉溶液。在造模5 h后處死切取受試關(guān)節(jié)滑膜。標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，組織切片。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色 按試劑盒要求操作，DAB 顯色，蘇木素襯染，脫水，透明，中性樹脂封片。

1.2.5組織學(xué)觀察和陽性程度判定 標(biāo)本在200倍光鏡下觀察，對核因子-κB陽性細胞計數(shù)：每例標(biāo)本觀察1 張切片，隨機選取5個視野，每個視野觀察100 個細胞，計算陽性細胞數(shù)，結(jié)果以陽性細胞百分率表示。僅細胞核著暗藍色者為陰性，細胞漿內(nèi)或核膜上呈棕黃色者為陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析。方差齊性檢驗后采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

正常對照組中核因子-κB 在滑膜及周圍組織細胞有較少的表達，染色相對較淺。與正常對照組相比，模型組滑膜組織中襯里層細胞、襯里下層浸潤的炎癥細胞、血管內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)和胞核內(nèi)均有明顯表達（P<0.01）。復(fù)方豨薟草膠囊組和痛風(fēng)定組核因子-κB表達較模型組有顯著減少（P<0.01），與正常對照組比較有顯著性差異（P<0.01），復(fù)方豨薟草膠囊組與痛風(fēng)定組間比較無顯著性差異（P>0.05）。見表1。

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)認為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎應(yīng)屬 “痹證”范疇。歷代醫(yī)家對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎一證有很多論述，如《丹溪心法·痛風(fēng)》描述痛風(fēng)的癥狀為“四肢百節(jié)痛是也”。《靈樞》謂之賊風(fēng)，《素問》謂之痹，《金匱》名曰歷節(jié)，后世更名曰白虎歷節(jié)，其病因病機為風(fēng)寒濕氣乘虛襲于經(jīng)絡(luò)，氣血相凝滯所致。我們認為急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎應(yīng)屬中醫(yī)濕熱痹證，由于風(fēng)熱濕邪侵襲，痹阻經(jīng)絡(luò)，流注關(guān)節(jié)，導(dǎo)致局部氣血運行不暢，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅腫、灼熱、疼痛，入夜尤甚。治宜清熱利濕，通絡(luò)止痛治療。

西藥治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎雖然能迅速，但是不良反應(yīng)明顯限制了其臨床應(yīng)用。中藥治療痛風(fēng)療效顯著，且毒副作用小，越來越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注和高度重視[4]。本實驗通過清熱祛濕中藥復(fù)方豨薟草膠囊對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中核因子-κB表達有顯著抑制作用，說明濕熱痹阻可能是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的主要中醫(yī)病機，也說明復(fù)方豨薟草膠囊在治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎抗炎作用機制中，抑制核因子-κB在滑膜組織中的表達是重要的一個方面。復(fù)方豨薟草膠囊組和痛風(fēng)定組核因子-κB表達較模型組都顯著減少，兩組間比較無顯著差異，但復(fù)方豨薟草膠囊減輕紅腫癥狀明顯。

NF-κB最初由Sen等[3]在1986年報道，他們在實驗中發(fā)現(xiàn)B細胞核提取物中有一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子κB序列特異結(jié)合的蛋白，由此將其命名為NF-κB。迄今為止，在哺乳動物細胞內(nèi)已發(fā)現(xiàn)有5種蛋白屬于NF-κB家族，分別為p65、c-Rel、RelB；p50/p105和p52/p100。NF-κB以同二聚體或異二聚體的形式存在于細胞內(nèi)，以p65/p50二聚體含量最豐富。未激活時，p65/p50二聚體與IκB結(jié)合，存在于胞質(zhì)內(nèi)。激活后IκB被磷酸化而降解，p65/p50從胞質(zhì)易位入核并與靶基因結(jié)合。增強其轉(zhuǎn)錄水平。IκB也是NF-κB的靶基因。NF-κB激活后，IκB重新合成并進人核內(nèi)與其再次結(jié)合，使后者從靶基因上脫離，以避免過度活化[5]。NF-κB能調(diào)節(jié)多種炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，與炎癥的發(fā)生和維持密切相關(guān)[6]。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜表達的許多炎癥介質(zhì)均為NF-κB的誘導(dǎo)劑或激活劑[7]。尋找NF-κB炎癥激活途徑的抑制物而不影響其生理活性是目前研究的重要課題。本研究發(fā)現(xiàn)模型組及藥物治療組急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB的表達水平均顯著高于正常對照組， 激活這一途徑可能對RA的發(fā)生、發(fā)展有重要意義。

參考文獻：

[1]Coderre J，Wall PD.AnkLe joinl Urale arthriris in ratan alternative animal modet of arthrills to that produced byFreund adjuvant[J].Pain，1987，28：379.

[2]Coderre J，Wall PD AnkLe joint urate arthritis in rat：provide a usefu r toot for the evaLuation of analysis and antiarthritis agents[J].Pharm Biochml Behav，1988，29（3）：461.

[3]Sell R，Baltimore D.lnducitbility of kappa immunoglobulin enhancerbinding prntein NF—kappa by a post-translational mechanism[J].Cel1，1 986，47：921-928.

[4]吳錦秋.中藥治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的研究進展[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2014，22（2）：79-80.

[5]Whiteside ST Isrel A，I kappa B.proteins：stucture，function and regulation[J].Semin Cancer Bio，1997，8：75-82.

[6]姚血明，馬武開，侯雷，等.重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白對CIA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜細胞NF-κB信號表達的影響[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，10（22）：1502-1505

[7]Sergei S.Makrov SS，NF-κB in rheumatoid arthrltis：a pivotalregulator of inflammation，hyperplasia，and tissuedestruction[J].Arthritis Res，2001，3：200-206.

編輯/肖慧