酶活性測定分析參數應用探討

摘要：目的 探討酶活性檢測時分析參數的設置。方法 對血清酶類檢測的波長、樣本體積分數、反應時間等參數給予優化設置。結果 通過對酶類主參數如樣本體積比、主輔波長、測量點和限額參數試劑吸光度值、線性度等進行設置，有效拓寬了方法學線性的范圍，確保了酶促反應線性期內測量酶的活性。結論 酶活性檢測時對分析參數進行正確檢測，可有效提升檢測的精準度。

關鍵詞：酶；活性檢測；分析參數；應用

隨著全自動生化分析儀的廣泛應用，使其已變成臨床診斷的首選方法之一，使得酶活性的檢測方法變得更加簡單，結果更為準確。但盡管如此，酶檢測至今仍然缺乏一個相對完善的操作流程，目前臨床上常用的方法均有對溫度進行測試，但由于儀器的聲場廠家、型號以及試劑等的差異性，導致酶活性的檢測結果也存在一定的差異。

1主要參數的設置

1.1樣本體積比[1] 即樣本體積和反應液總體積的比值。樣本體積比涵蓋樣本體積、樣本稀釋液體積、試劑體積以及試劑稀釋液體積等等，樣本體積值的變化同酶轉化率無相關性，所以，對樣本體積值應嚴格限定。正常情況下，樣本在反應液總體積中所占比值應偏小，這樣可預防樣本中其他物質的影響，且能確保檢測時有足夠大的線性范圍。血清和時機比值在特定范圍內進行修改，其結果不會產生較大影響[2]?？稍谂R床實踐中，還應充分考慮因為樣本量不夠大，酶催化反應速度遲緩而形成偏差，諸如谷丙轉氨酶檢測，其公式是：U/L=△A/min×1/6300×106×3.0/0.3=△A/min×1587，系數（F）等于1587，檢測時間是2min，計算過程中，如果吸光度產生±0.001的偏差，則會造成檢測結果產生±0.8U/L的差異，對一個正常上限的樣本而言，則會出現±2的偏差，樣本的活性越差，相對偏差值就會越大。但是，若是再縮小樣本，將會出現更嚴重的偏差。此外，在進行樣本量和試劑量的選擇時，還需充分判斷生化分析儀的性能，不可為了節約成本而忽視了生化分析儀設置的比色杯最小反應體積，要確保樣本量、試劑量、稀釋液量的總和滿足儀器標準。

1.2檢測方法學 從80年代中末期開始，在自動生化分析儀不斷被應用的過程中，商品化試劑盒也得到了廣泛應用，這讓酶的檢測方法也獲得創新，連續監測法因此得到了大力推廣。該方法用來檢測酶所催化的反應速率，可計算酶含量，因此也被稱作酶活性檢測法。在應用此方法前，必須先觀察酶促反應的時間曲線，以了解整個反應過程，進而明確延遲期、線性反應期、混合期，以準確進行起始時間的檢測。

1.3波長的確定 自動生化分析儀可用單波長或雙波長進行檢測，單波長檢測的結果較不穩定，會受溶血等因素影響，雙波長檢測時可借助輔波長進行完善，以減低影響因素，進而確保檢測結果的準確性。進行波長確定時，可選主波長或主波長與輔波長同時選定。例如，進行谷丙轉氨酶檢測時，常選擇340nm波長，目前已經明確認定，NADH的吸收峰是339nm，在所選波長半波寬小于2nm的情況下，NADH的摩爾消光系數不會有任何變化。必須注意的是，輔波長是單點監測者F值直接由ε得出，但結果的穩定性比不上雙波長，而輔波長為全程監測時F值需由ε主-ε輔得出。

1.4延遲時間與測量時間[1] 進行酶活性的檢測時，為了減少內源性酮酸的影響，酶和底物混勻后，應經延遲后方可進入線性反應期。例如，在進行谷丙轉氨酶檢測時，添加2-氧代戊二酸后，谷丙轉氨酶便開始進行催化反應，生成丙酮酸，因為開始時反應系統中無丙酮酸或丙酮酸的含量非常少，指示反應無法同檢測反應同時間進行，必須經過一定時間方會出現平衡，進而進入一個線性反應期。前一階段是延遲期，后一階段是一個常見的反應過程，檢測時間應是線性期的零級反應。進行延緩時間同檢測時間的篩選時，要先觀察活性高低不同的二類標本的延遲期和線性期，進而明確測量點。

2限額參數的設置

即，在自動生化分析儀上限額參數有線性度、線性范圍、最大吸光度以及最小吸光度等。限額參數的設置與檢測結果有較大關聯，限額參數的設置越準確，則檢測結果越精確。例如，最小吸光度與最大吸廣度，在酶活性檢測的負反應中，最小吸光度值的設置必須精確，若未進行設置或設置不精確，則檢測過程中一旦底物耗光，而自動生化分析儀又無法自動辨別時，就會出現錯誤的結果[3，4]。無延緩時間參數，對于單試劑酶檢測，如谷丙轉氨酶檢測時，延緩時間中涵蓋了內源性酮酸和乳酸造成的吸光度降低，該情況下，若選擇不要延緩時間，一旦出現高活性樣本，檢測時間就會自動引進延緩時間，導致檢測結果的偏差。因此，所以更換試劑廠家，在應用前應先認真閱讀使用說明書，按照要求進行參數設置[5]。

3測定系數（K）的計算

常規生化項目通常都有校準品供應，能為所檢測的項目進行校準定標，以確保檢測結果不會造成太大偏差。但是在酶類項目的檢測中，因為其自身較特殊，且容易受多種因素影響，導致其檢測結果常會存在一定的偏差。酶活性值（U/L）=（TV×103/∑×b×SV）×△A/min，其中，系數K=TV×103/∑×b×SV，所以，K值的準確度直接影響酶活性測定值的準確度。生化分析儀的臨床應用，實測K值往往會發生變化[6]，生化分析儀維護更換燈泡或室內質控發生漂移時應進行實測K值的校正。

參考文獻：

[1]張曉珍，姜軍，張娣.全自動生化分析儀實驗參數解析[J].中國療養醫學，2012，21（9）：814-815.

[2]郭群.自動生化分析儀血清與試劑比例的實驗探討[J].臨床檢驗雜志，1994，12（3）：137-134.

[3]李雷，張葵.酶類測定底物耗盡的監測[J].臨床檢驗雜志，2000，18（2）：96.

[4]羅梅，賀巖，張曉宇.全自動生化分析儀參數設置與應用[J].國際檢驗醫學雜志，2012，23（2）：222-223.

[5]劉躍平.反應曲線在全自動生化分析儀限額參數設置中的應用[J].檢驗醫學與臨床，2013，10（增刊I）：210-211.

[6]王成河.自行設定酶活性測定的K值[J].實驗與檢驗醫學，2008，26（5）：565-566.

編輯/孫杰