基于產品技術要求的PCR類檢測試劑的質量控制

摘要：結合PCR類檢測試劑產品工藝特點、產品技術要求及《體外診斷試劑注冊管理辦法》等現行法規的要求，分析PCR類檢測試劑生產過程中的生產環境、原材料質量要求、工藝用水及產品性能檢測等方面的關鍵控制點，為該類體外診斷試劑在生產質量管理和產品注冊方面提供一定的技術參考。

關鍵詞：PCR類檢測試劑；產品技術要求；質量控制

Abstract：Combining with the characteristics of PCR Detection Reagents， product technology requirement and the current regulations requirements such as measures for the administration of IVD registration， the article analysis the critical control points about environmental requirements、raw materials quality、process water and testing methods in manufacture process of PCR detection reagents，so as to to provide certain technical reference for its product quality management in manufacture process and product registration.

Key words：PCR detection reagents；Product technical requirements； Quality control

PCR類檢測試劑是指運用PCR檢測技術，在體外對人體血液等樣本中提取的DNA或RNA進行檢測分析的產品。目前PCR類檢測試劑常基于原位雜交法、熒光定量PCR法、反向點雜交法等技術在體外實現病原體的檢測、特定疾病診斷及基因多態性的分析等臨床用途。PCR類檢測試劑目前按照三類體外診斷試劑管理，自新版《醫療器械質量監督管理條例》于2014年6月1日實施以后，法規對體外診斷試劑注冊申報資料提出了更高要求。其中《體外診斷試劑注冊管理辦法》中提出第三類體外診斷試劑產品技術要求具體內容等的要求。本文則基于體外診斷試劑的產品技術要求，總結與分析PCR類檢測試劑生產過程的質量控制。

1 生產工藝及操作環境控制

PCR類檢測試劑一般由PCR反應液、核酸提取液、酶液等部分組成，常配帶陰性、陽性參考物或對照品。基于探針雜交法的試劑還包括固相載體（如尼龍膜、NC膜、微孔板等）。該類試劑的生產工藝因結合技術不同而有差異性，但大致可以總結為：配液、分裝、中間品檢測、成品包裝及成品檢測，探針雜交法前期會涉及探針的構建、質粒抽提、純化等，每一工藝環節應按照經驗證符合要求的參數進行控制，需與已經核定的產品技術要求中附錄的工藝研究保持一致。如配液需注意PH值、濃度、澄明度、無固體不溶物等，分裝則對裝量差、均一性等進行控制。

基于新法規《醫療器械生產質量管理規范附錄體外診斷試劑》的要求，該類試劑的配制、分裝應在十萬級潔凈車間內完成。而陰、陽性對照品等涉及血源性或質粒的抽提、純化、稀釋、配制及分裝過程應當在至少萬級潔凈環境下進行，與相鄰區域保持相對負壓，并符合防護規定。為避免擴增過程產生的氣溶膠造成交叉污染，生產與檢驗區應在各自獨立的建筑中或空間中進行。另外，結合產品本身質量要求應當對環境進行特殊控制，如涉及熒光雜交法中探針上的熒光基團見強光容易發生淬火，故在涉及探針雜交、雜交后洗滌等處理過程需在避光環境下操作。

試劑反應體系的易污染性決定了實驗室檢測區域應嚴格劃分和合理分布走向。進入各個工作區域的人員及物品必須嚴格遵循單一從上游操作區到下游區的原則，即只能從樣本處理區、目的基因提取區、擴增區至產物分析區，但若采用的檢測設備能實現擴增分析自動化全過程，可以根據實際情況合并最后兩區域。PCR類檢測試劑的實驗區具體可參照《臨床擴增分析實驗室設置》的要求進行設置。操作人員需嚴格按照規定佩帶手套及穿工作服，避免裸手操作造成核酸污染。移液搶等配制器具應定期用10%次氯酸鈉消毒或經高壓滅菌處理，操作臺應開啟紫外線照射消毒等。

2原材料控制

《體外診斷試劑注冊管理辦法》中提出第三類體外診斷試劑產品技術要求中應當以附錄形式明確主要原材料。因此，企業在PCR類檢測試劑研發試制過程就應明確原材料的來源、質量級別、安全性特性及檢測方法等信息，并按實際原材料及反應體系的研究情況輸出技術要求。原材料的控制分兩種情況：①原材料外購時，企業應制定符合要求的供應商評審和采購控制程序，要求供方提供原材料的質量標準及出廠檢測報告，必要時企業需對關鍵原材料的主要性能指標進行驗證或功能性實驗，保留相應驗證及檢測報告。外購參考品、標準品時還需供應商提供溯源情況。對供方的管理可參照《醫療器械生產企業供應商審核指南》（國家食品藥品監督管理總局通告2015年第1號）。②原材料為企業自備時，需嚴格按照驗證后穩定的工藝進行控制，符合質量要求才能放行轉入生產環節。

PCR類檢測試劑主要原材料包括dNTP、引物、探針、酶系、緩沖液、陽離子等。根據具體原材料的特性不同應分別制定質量標準。如dNTP、引物、探針等需滿足色譜純級別、分子量達到規定值，引物、探針需明確其核酸序列。生產企業內部應以自測或供應商提供的HLPC分析圖譜、分子量報告等作為原料驗證性資料。目前引物一般通過化學方法合成，其設計過程應考慮避免形成二聚體、發夾結構及錯配等導致非特異性擴增條帶。上述原材料的保存應無DNase（脫氧核糖核酸酶）及RNase（核糖核酸酶）污染，并應在-20℃低溫下保存避免高溫分解以影響PCR反應過程。酶系則需具備相應酶活性及效價，并需經過自行驗證，應在-20℃低溫下保存。其他普通試劑（如緩沖液、陽離子溶液）需滿足分析純級別，室溫保存。所有原材料應按照狀態、用途及存儲要求分類管理及存放，標明品名、生產日期（配制日期）及失效日期，防止混用誤用。

3工藝用水管理

工藝用水在試劑反應體系中充當重要角色。可以歸納兩種用途，一是作為試劑組成部分參與配制工作，二是作為介質參與環境控制、容器具及衣物的清洗。若工藝用水作為試劑反應體系的組成部分，也應在技術要求中以原料形式明確工藝用水質量級別及要求。

工藝用水的質量標準應結合產品特性及工藝要求制定。PCR類檢測試劑的檢測容易受細菌、核酸、離子及有機物污染干擾，故在試劑配制生產及檢測過程使用經過嚴格控制離子濃度、酶污染、避免核酸污染及低有機物的高純水。比如試劑緩沖液等配制用水、分裝與移液器具的末道清洗應用符合分子生物學使用標準的去離子水或滅菌超純水，避免帶入污染。而涉及RNA的試驗用水需無RNase、DNase和Proteinase污染的水，可使用DEPC（焦碳酸二乙酯）來處理（即DEPC加入去離子水中溶解而得，配成濃度為0.1%，最后經高溫高壓除去DEPC）。企業應根據產品特性、試劑反應體系、選用的制水設備和相應檢測技術制定工藝用水標準、用量、種類、存放環境及期限，相關參數可通過試制、監測等過程進行驗證。作為參與十萬級潔凈度要求的環境控制及潔凈服清洗的工藝用水則應符合純化水的要求，該水質檢測要求應參照中國藥典中純化水的質量要求。體外診斷試劑工藝用水質量指標可參照標準《YY/T 1244-2014體外診斷試劑用純化水》的要求。由于PCR類檢測試劑的特殊性，企業應在參照行業標準及藥典基礎上制定符合本產品質量要求的工藝用水控制文件。

純化水的制備目前多采用二級反滲透制水系統，超純水則通常以純化水為原水，再進一步過濾制備而得。水制備系統要經過一定的周期驗證及確認，并在日常生產過程按照經驗證過的質量要求及規程進行水質監測。企業產品工藝用水的管理建議參照《醫療器械工藝用水質量管理指南》（國家食品藥品監督管理總局總局通告2016年14號）。

4質量控制與保證

4.1 性能檢測 性能指標及其相應的檢驗方法作為技術要求最核心的部分，應對制定的指標內容進行嚴格驗證及確保與法規、相關標準的符合性。該試劑生產過程的質量控制可通過半成品或成品來檢測內部參考品或國家參考品的方式來評價性能指標的符合性。若企業采用內部參考品，則應明確參考品的選擇（可以是質粒、臨床樣本、假病毒等）、制備工藝的穩定性及其定值過程等。內部參考品如制成凍干粉的，建議符合生物制品中的質量要求，如水分含量<3%等，溶解后標示值差量范圍在規定值內。若采用國家參考品應明確其溯源情況及可查詢的有證編號。

性能檢測項目通常包括：線性范圍、準確度、精密度、特異性、檢測限等。

4.1.1 線性范圍 按照相關產品行標要求，線性范圍內相關系數絕對值一般要求大于0.98。一般選取接近線性范圍上限的高值樣本按照一定比例稀釋為多個濃度進行檢測，最好涵蓋上下限值。

4.1.2準確度 評價產品的準確度需要在分析性能評估階段中通過方法學的對比、回收試驗、偏差分析等進行研究。對于定性產品，應對陰陽性參考品進行檢測，符合率應為100%；對于定量產品，對國家標準品或參考品進行檢測，絕對偏差或回收率應符合相關行標要求值。

4.1.3批內精密度 檢測批內精密度應使用同一批試劑對底中高濃度值的重復性參考品進行重復檢測，其變異系數應符合行標規定。對于定性產品而言，應對閥值循環數Ct值的變異系數進行評估，定量產品則為檢測重復性參考品的濃度值的變異系數。

4.1.4批間精密度 檢測批間精密度應使用不同批次試劑對底中高濃度值的重復性參考品進行重復檢測，其變異系數應符合行標規定。

4.1.5特異性 分析產品的特異性在性能評估中需考慮內源性干擾物質、樣本的添加劑及容易發生交叉反應物質的影響。特異性參考品通常選用與被測物類似、感染部位相同，表型類似等易產生交叉反應的物質的陰性參考品組成。檢測的結果應滿足陰性100%的符合率。

4.1.6 檢測限 一般使用國際參考品/國家參考品或企業參考品進行一定倍數梯度稀釋，對同一濃度應進行多次檢測，將具有95%陽性檢出率的水平作為檢測限，最終應對聲稱的檢測限附近值進行多次驗證。

4.2排除干擾體系 該試劑質控過程還應考慮干擾體系的存在，往往需要采用質控品進行平行試驗來進行質量控制。為防止試劑實際使用過程中出現假陰性，部分產品帶有內標組分，內標組分通常選擇質粒菌或假病毒，更好在使用過程對樣本核酸提取、擴增等步驟的假陰性過程進行監控。而在實際生產過程，企業需不斷進行內部的質控，質控品可分為陽性質控及陰性質控。陽性質控可以排除因抑制因子、靶核酸降解等因素造成假陰性結果，故除了陽性質控品應與待測樣本的靶核酸性質（同為DNA或RNA）一致外，還應考慮基質效應，使用與患者標本相同的主反應混合液。而陰性質控品用以對可能存在的交叉污染、實驗操作人為誤差等造成的假陽性結果的質控。此外，為降低污染一般在擴增過程加入尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG），原料用dUTP代替dTTP，可以降低交叉污染的PCR產物。

為提高結果的準確性，選用血液樣本時應排除規定值外的干擾物質（如高濃度膽紅素、血脂等）和影響提取核酸效率的物質，該規定值應為經過抗干擾性評估得出的結果。

4.3穩定性試驗和留樣 評價產品的有效性及監測產品質量情況，還應對產品的穩定性進行研究和留樣觀察。穩定性項目一般包括有效期穩定性、實際存儲條件下的開瓶穩定性、試劑凍融次數穩定性及產品運輸穩定性研究等，其中效期穩定性研究應至少對三批試劑進行試驗并保留結果。

產品留樣應根據產品特性和保存期限建立留樣觀察制度，制定留樣復驗項目周期及設置專門的留樣室。留樣數量應滿足產品技術要求中全項目檢測的用量。一般留樣觀察可分為一季度、半年或一年的觀察記錄，周期較短內可僅對外觀、產品狀態、澄明度（如液體）、包裝標簽完整性等進行記錄，一年內至少應對不同批次產品進行全性能復驗并記錄，必要時對檢測記錄進行趨勢分析從而評價產品質量穩定性。

5結論

基于產品技術要求和產品特性，PCR類檢測試劑的質量保證應而不局限于上述幾個環節得到控制。為確保產品的安全有效性，注冊申請人應從產品風險角度及工藝特性，不斷探究質量控制環節和完善生產過程質量的標準來提高質量管理水平。

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