淺談心肌細胞培養技術及其進展

摘要：細胞培養技術是生物醫學研究中最常用和最重要的技術之一，本文就心肌細胞的經典培養模型和新進展作一綜述。

關鍵詞：心肌細胞；細胞培養；三維培養

Abstract：Cell culture is one of the most commonly used and the most important techniques in the biomedical research. In this paper， the classical cardiomyocyte culture methods and the latest progress in this field are reviewed.

Key words：Cardiomyocyte；Cell culture；Three-dimensional cultivation

細胞是生物體結構和功能的基本單位，也是疾病發生和轉歸的基礎。因此，細胞是生物醫學研究中最重要的環節。在體細胞研究存在諸多局限性，如成本高、影響因素復雜、可重復性差等，為解決這些困難，離體細胞培養技術應運而生。細胞培養（cell culture）是細胞在離體條件下的克隆性增殖過程，具有成本低、周期短、數量多、單克隆性、條件可控等諸多優勢。可以說，細胞培養技術是生物醫學研究中最基礎最重要的技術之一。本文僅就心肌細胞培養技術及其進展作一淺述。

1經典心肌細胞培養模型

鼠心肌細胞是心肌細胞培養最常用的材料，包括未成熟心肌細胞（immature cardiomyocyte，ICM）和成熟心肌細胞（adult cardiomyocyte，ACM）兩種。ICM培養技術是由Harary等在1960年建立的[1]，經過后人改進形成了經典的Simpson培養法[2]。ICM主要來源于胚胎鼠和乳鼠，以出生3 d內的乳鼠心室肌細胞最常用。ACM相互間有大量閏盤和外基質緊密相連，又沒有分裂增殖能力，其分離和培養比ICM要困難得多，直到上世紀60年代才通過逆行主動脈生物酶灌注法分離出單個ACM[3]，但是當時ACM因置于生理濃度鈣溶液中而迅速死亡，這個現象被稱為\"鈣反常（calcium paradox）\"[4]。1976年， Powell首次報道了分離活性的鈣耐受成熟心室肌細胞的技術[5]。Jacobson則在1977年首次成功培養出ACM。

經典的心肌細胞培養技術包括細胞分離、純化、接種、培養和傳代培養等步驟。

1.1心肌細胞的分離 ICM的分離一般采用組織塊消化法，即將心肌組織剪成小碎塊，然后加入消化分離液將心肌細胞和非心肌細胞分開。消化分離液的主要成分是生物酶，常用的有胰蛋白酶、膠原酶和透明質酸酶[6]，其中胰蛋白酶作用最強，但也最容易損傷心肌細胞；膠原酶作用溫和；透明質酸酶作用弱，不宜單用。目前多采用兩種或三種消化酶聯合，以胰蛋白酶和膠原酶Ⅰ聯合最常用。消化分離液中可加入牛血清白蛋白以保護心肌細胞，提高細胞質量[7]；也可加入脫氧核糖核酸酶，防止DNA聚積在心肌組織表面而影響分離效率[6，8]；乙二胺四乙酸（EDTA）是一種常用的螯合劑，能吸附溶液中的Ca2+、Mg2+等金屬離子而促進細胞分離（細胞間粘附因子發揮作用需有上述金屬離子存在），而且對細胞功能影響極小[9]，故加入EDTA可進一步提高分離效率，但是EDTA不能被血清中和，后續必須洗凈，以免影響細胞貼壁。心肌細胞分離后加入含胎牛血清的培養液以終止消化，即得到初步的心肌細胞懸液[10]。在實際操作中，消化分離液的酶類、酶濃度、溫度、攪拌轉速及時間長短等因素相互影響、相互制約，需要反復摸索才能得到最佳方案。

ACM的分離方法相對更復雜，主要有組織浸泡法、貼塊培養法和離體心臟生物酶灌注法。效果最好和最常用的是離體心臟生物酶灌注法，又稱為Langendorff離體心臟灌注法，是Oscar Langendorff在1895年發明的[11]，經過預熱、消毒、洗滌、經升主動脈逆灌消化酶溶液循環灌流、震蕩釋放心肌細胞和梯度復鈣等步驟，最終得到活性的單個ACM[12，13]。

1.2心肌細胞的純化 心肌組織由多種細胞構成，以心肌細胞和成纖維細胞樣細胞數量最多。在體外培養的特殊環境中，非心肌細胞對心肌細胞的影響是巨大的，主要表現在：①非心肌細胞貼壁和生長增殖能力更強，容易成為優勢細胞，通過空間競爭、分泌抑制因子等機制影響心肌細胞的生長增殖和功能[14，15]；②非心肌細胞對干預因素的反應與心肌細胞不同，影響實驗結果。因此，細胞分離后的純化是必要的。常用的純化方法有差速貼壁法和化學試劑法，主要是除去成纖維細胞樣細胞：①差速貼壁法利用不同細胞貼壁速度的不同（心肌細胞貼壁較慢）進行分離和純化。通過差速貼壁法純化的心肌細胞純度可達到90%以上[16，17]，且操作簡單、成本低、對心肌細胞影響小，但缺點是作用時間短，不能單獨用于長時間培養的實驗；②化學試劑法利用某些化學試劑對不同細胞的抑制強度不同來達到純化目的。5-溴脫氧尿嘧啶核苷可明顯抑制成纖維細胞樣細胞增殖，而對心肌細胞影響小，是心肌細胞純化常用的試劑[18，19]。化學試劑能夠持續起作用，但缺點是對心肌細胞可能具有潛在影響。在實際操作中，差速貼壁法和化學試劑法常聯用。

1.3心肌細胞接種和培養 細胞培養基分天然培養基和合成培養基兩種，后者更常用。心肌細胞常用的培養基有DMEM、M199、MEM、EMEM等。為了促進細胞貼壁，培養基中可加入促吸附因子（Ⅰ型膠原、Ⅵ型膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白等）；為了預防細菌污染，有時加入抗生素[20]。細胞密度是影響細胞生長、增殖、分化表型、生存時間等的重要因素，接種密度需根據實驗目的而定，如果是為了觀察單個細胞的行為，密度宜較低，一般為1～2×105/mL；如果是為了獲取細胞產物，密度則宜較高，一般為5～6×105/mL[21]。接種在多孔培養板時，應放棄周邊孔并加入空白培養基以避免\"邊緣效應\"。

ACM的培養比較復雜，分為去分化法和快速吸附法兩種[22]。去分化法使用含血清培養基培養，研究表明[23]，通過該法培養的ACM在超微結構、分子水平和電生理水平表型上都發生了\"去分化（dedifferentiation）（向胎兒表型的逆轉）\"，因此被稱為\"去分化法\"。去分化法的優點是細胞存活時間較長，達數周到數月，缺點是發生了表型逆轉而且逆轉程度尚不明確[24]，也正因為如此，現在多采用快速吸附法。快速吸附法是將ACM接種在經促吸附因子預處理過的基質上，使用無血清培養基培養。ACM可在接種3 h內吸附到培養基質上，并且始終保持急性分離時的柱形、紋狀形態，也不會自發性收縮，尤其適用于分子生物學和電生理試驗[25]。快速吸附法的缺點是細胞存活時間較短，只有1～2 w。

1.4 ICM的傳代培養 ICM具有分裂能力，為了調節細胞密度，有時需要傳代培養。傳代培養實質上是將原代細胞收集起來稀釋后重新接種和培養的過程。由于心肌細胞是貼壁生長的，傳代培養的關鍵是使細胞脫壁、分離成細胞懸液，分離方法主要有兩種：①生物酶法：加入低濃度（0.01%～0.05%）胰蛋白酶溶液使細胞分離；②機械法：通過吸管的刮吹使細胞分離。

2心肌細胞三維培養技術

經典的心肌細胞培養模型，細胞接種在二維基質中，與在體的三維環境完全不同，勢必導致細胞在結構和功能上發生一系列適應性改變，影響科學研究的效果。所以，人們迫切需要一種既能盡量保留在體細胞的結構和功能特點、又具有體外培養優勢的技術。隨著生物、材料、納米、組織工程等學科的快速發展，細胞三維培養技術應運而生了[26]。

劉霞等用三維的PLGA泡沫支架材料培養乳鼠心肌細胞，觀察到心肌細胞形成了心肌組織樣結構，超微結構保持良好，代謝活性也較二維培養更高[27]。劉興茂等將乳鼠心肌細胞接種于鼠尾膠原膜三維支架中培養，并與二維培養作橫向比較，發現三維培養的心肌細胞保持了良好的形態和功能[28]。Eschenhagen等將雞胚心肌細胞接種到膠原凝膠上，觀察到心肌細胞形成了可收縮的網絡結構[29]。Hussain等將乳鼠心肌細胞與成纖維細胞共同接種于經層粘連蛋白處理過的生物活性殼聚糖納米纖維三維支架中，發現心肌細胞能長期維持在體的形態和功能，形成同步化收縮[30]。

總之，心肌細胞三維培養技術還方興未艾，是未來的發展方向之一。

3結論

心肌細胞培養技術已走過半個多世紀的歷史，廣泛應用于電生理、信號通路、細胞凋亡以及藥物安全性評價和新藥篩選等領域，為生物醫學的發展作出了巨大貢獻。同時，隨著三維培養、反義寡核苷酸和基因轉染等新技術手段的涌現，心肌細胞培養技術又是歷久彌新、蒸蒸日上，必將為人類的健康事業更立新功。

參考文獻：

[1]Harary I， Farley B.In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science，1960，131：1674-1675.

[2]Simpson P，Savion S.Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations，ultrastructure， and chronotropic response to isoproterenol.Circulation research.1982，50：101-116.

[3]Kono T. Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues. Biochimica et biophysica acta，1969，178：397-400.

[4]Farmer BB， Mancina M， Williams ES， et al. Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts： Review of the literature and description of a method. Life sciences.1983，33：1-18.

[5]Mitcheson JS，Hancox JC，Levi AJ.Cultured adult cardiac myocytes： Future applications， culture methods， morphological and electrophysiological properties.Cardiovascular research.1998，39：280-300.

[6]Suzuki T，Ohta M，Hoshi H.Serum-free， chemically defined medium to evaluate the direct effects of growth factors and inhibitors on proliferation and function of neonatal rat cardiac muscle cells in culture[J].In vitro cellular developmental biology：journal of the Tissue Culture Association，1989，25：601-606.

[7]Marino TA，Walter RA，Cobb E，et al.Effects of norepinephrine on neonatal rat cardiocyte growth and differentiation[J].In vitro cellular developmental biology：journal of the Tissue Culture Association，1990，26：229-236.

[8]Boerma M，van der Wees CG，Wondergem J，et al.Separation of neonatal rat ventricular myocytes and non-myocytes by centrifugal elutriation.Pflugers Archiv[J].European journal of physiology，2002，444：452-456.

[9]楊勝利，何作云，張華，等.大鼠心肌細胞培養方法的改進[J].中國比較醫學雜志，2003（03）.

[10]Webster KA，Discher DJ，Bishopric NH.Induction and nuclear accumulation of fos and jun proto-oncogenes in hypoxic cardiac myocytes[J].The Journal of biological chemistry，1993，268：16852-16858.

[11]Zimmer HG.The isolated perfused heart and its pioneers.News in physiological sciences：an international journal of physiology produced jointly[J].International Union of Physiological Sciences and the American Physiological Society，1998，13：203-210.

[12]Ellingsen O， Davidoff AJ， Prasad SK， et al. Adult rat ventricular myocytes cultured in defined medium：Phenotype and electromechanical function[J].The American journal of physiology，1993，265：H747-754.

[13]廖華，糜濤，涂志業，等.成年大鼠心肌細胞分離方法的改良[J].中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（33）：6536-6539.

[14]中醫研究院西苑醫院基礎研究所.心肌細胞的培養及形態的初步觀察[J].中華心血管病雜志，1998（9）：216.

[15]Miragoli M，Gaudesius G，Rohr S.Electrotonic modulation of cardiac impulse conduction by myofibroblasts[J].Circulation research，2006，98：801-810.

[16]Bes S，Roussel P，Laubriet A，et al.Influence of deep hypothermia on the tolerance of the isolated cardiomyocyte to ischemia-reperfusion[J].Journal of molecular and cellular cardiology，2001，33：1973-1988.

[17]Schroedl NA，Hartzell CR.Myocytes and fibroblasts exhibit functional synergism in mixed cultures of neonatal rat heart cells[J].Journal of cellular physiology，1983，117：326-332.

[18]沈靜，謝苗榮，徐雍，等.乳鼠心肌細胞培養及純化方法的改良[J].中國醫藥導刊，2001（3）：225-226.

[19]Miki N，Hamamori Y，Hirata K，et al.Transforming growth factor-beta 1 potentiated alpha 1-adrenergic and stretch-induced c-fos mrna expression in rat myocardial cells[J].Circulation research，1994，75：8-14.

[20]Rohr S，Scholly DM，Kleber AG.Patterned growth of neonatal rat heart cells in culture. Morphological and electrophysiological characterization[J].Circulation research，1991，68：114-130.

[21]王濤，余志斌，謝滿江，等.新生大鼠心肌細胞培養技巧[J].第四軍醫大學學報，2003，24：封2-01.

[22]Jacobson SL， Piper HM. Cell cultures of adult cardiomyocytes as models of the myocardium[J]. Journal of molecular and cellular cardiology，1986，18：661-678.

[23]Claycomb WC， Burns AH， Shepherd RE. Culture of the terminally differentiated ventricular cardiac muscle cell. Characterization of exogenous substrate oxidation and the adenylate cyclase system[J].FEBS letters，1984，169：261-266.

[24]Benardeau A，Hatem SN，Rucker-Martin C，et al.Primary culture of human atrial myocytes is associated with the appearance of structural and functional characteristics of immature myocardium[J].Journal of molecular and cellular cardiology，1997，29：1307-1320.

[25]Mitcheson JS，Hancox JC，Levi AJ.Action potentials，ion channel currents and transverse tubule density in adult rabbit ventricular myocytes maintained for 6 days in cell culture[J].Pflugers Archiv ： European journal of physiology，1996，431：814-827.

[26]Voytik-Harbin SL.Three-dimensional extracellular matrix substrates for cell culture[J].Methods in cell biology，2001，63：561-581.

[27]劉霞，史明艷，歐陽五慶.乳鼠心肌細胞的體外三維培養[J].西北農林科技大學學報（自然科學版）2010，37（3）：66-70.

[28]劉興茂，劉紅，熊福銀，等.以膠原膜為支架的心肌細胞體外三維培養[J].生物工程學報，2003，19（4）：484-488.

[29]Eschenhagen T，Fink C，Remmers U，et al.Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix： A new heart muscle model system[J].FASEB journal ： official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology，1997，11：683-694.

[30]Hussain A，Collins G，Yip D，et al.Functional 3-d cardiac co-culture model using bioactive chitosan nanofiber scaffolds[J].Biotechnology and bioengineering，2013，110：637-647.

編輯/丁一