肺炎鏈球菌的檢驗技術(shù)探析

摘要：肺炎鏈球菌臨床上容易引起大葉性肺炎，對人體造成較大的危害，特別是有莢膜的肺炎球菌可以抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬，細(xì)菌可以在寄主體內(nèi)大量繁殖。而由于臨床長期藥物使用的不規(guī)范，造成了肺炎鏈球菌的耐藥性變化，致使多種藥物治療效果降低或無效，臨床對肺炎鏈球菌檢驗主要為明確肺炎鏈球菌的類型，并依據(jù)不同的類型進(jìn)行治療的數(shù)據(jù)支持，意義重大。本次研究主要為肺炎鏈球菌的檢驗技術(shù)和進(jìn)展分析，探討近年來肺炎鏈球菌檢驗方法和手段，并對肺炎鏈球菌的耐藥性和分子流行病學(xué)的研究方法進(jìn)行總結(jié)，具有一定的臨床參考意義。

關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌；檢驗技術(shù)；進(jìn)展；耐藥性分析

肺炎鏈球菌（Setrt Pococcuspneumoinae）簡稱肺炎球菌，是1881年首次由巴斯德及G.M.Stembegr分別在法國和美國分離出來。肺炎球菌菌體似矛頭，呈短鏈狀排列或成雙排列的球菌，革蘭氏陽性，絕大多數(shù)兼性厭氧，偶有專性厭氧，肺炎鏈球菌的主要致病物質(zhì)是肺炎球菌溶血素和莢膜[1]。近年來，越來越多的國家和地區(qū)出現(xiàn)耐藥性肺炎鏈球菌菌株的報道，嚴(yán)重威脅著肺鏈感染的臨床治療，已成為一個嗆待解決的健康問題。

1藥敏試驗

1.1微量稀釋法 該法是美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）推薦的肺炎鏈球菌藥敏試驗的參考方法。該法主要使用經(jīng)過離子校正的M-H肉湯+2%～5%的溶血馬血作為培養(yǎng)基的，然后將抗生素稀釋后加人培養(yǎng)基中。將在羊血平板上的菌落制備菌液，以0.5 濁度分裝微量板。在35℃普通條件下培養(yǎng)24h后，人工判斷結(jié)果。具體 MIC見NCCLS的判定標(biāo)準(zhǔn)[2]。

1.2紙片擴散法 NCCLS推薦使用的紙片法藥敏試驗，主要使用羊血平板，以0.5濁度的菌液接種平板。對于臨床分離株的藥敏試驗，CO2是必備的環(huán)境。平板應(yīng)于35℃條件下在5%的CO2中培養(yǎng)24h后進(jìn)行測量，從正面量取。抑菌環(huán)的大小和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)詳見NCCLS的規(guī)定。紙片擴散法的優(yōu)點是簡單方便，對非β-內(nèi)酞胺藥物的重復(fù)性、準(zhǔn)確性均較高，但是在應(yīng)用于青霉素和頭抱類抗生素時準(zhǔn)確性明顯降低[3]。

2肺炎鏈球菌的耐藥性檢驗

目前有很多實驗室在對血液、腦脊液等體液分離得到的肺炎鏈球菌耐藥性測定時，只檢測青霉素的耐藥性。事實證明，多重耐藥和對三代頭抱耐藥的肺炎鏈球菌越來越多，因此，NCCLS已經(jīng)明確要求，從腦膜炎者分離出來的肺炎鏈球菌必須做青霉素、頭孢曲松或者頭孢他啶的MIC，另外還應(yīng)檢測對萬古霉素的耐藥性。對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外分離而來的肺鏈球菌， 則首先應(yīng)該選用苯唑西林來檢測其是否對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥。若抑菌環(huán)>200 mm，證明其對青霉素和β-內(nèi)酞胺類藥物敏感物耐藥性；若抑菌環(huán)<19 mm，則須進(jìn)一步檢測其對青霉素、頭孢曲松或頭孢他啶的耐藥性。同時，對于非中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離的菌株還應(yīng)進(jìn)行紅霉素、復(fù)方磺胺藥物敏感性的測定。阿奇霉素、克拉霉素等新大環(huán)內(nèi)脂類藥物 的敏感性則可通過紅霉素藥敏試驗結(jié)果推知，而不必進(jìn)行常規(guī)的檢測[4]。自1965年波士頓報道了首例耐青霉素肺炎鏈球菌以來，世界各地不斷有耐藥性肺炎鏈球菌的菌株被發(fā)現(xiàn)，雖然各地報道的耐藥率和檢出率不盡相同，但是一個總的趨勢就是，肺炎鏈球菌耐藥性正在逐年上升。臨床上和實驗室應(yīng)該特別注重肺炎鏈球菌耐藥性的檢測和使用抗生素進(jìn)行治療。

3微生物學(xué)檢查

3.1標(biāo)本根據(jù)感染部位不同采取不同標(biāo)本，如痰液、膿液、血液、腦脊液等。

3.2直接涂片鏡檢對痰、膿或腦脊液沉淀物標(biāo)本，可涂片進(jìn)行革蘭染色鏡檢，若發(fā)現(xiàn)典型的成雙排列、有莢膜的革蘭陽性球菌，結(jié)合臨床癥狀可做初步診斷。

3.3分離培養(yǎng)與鑒定將痰或膿液直接接種于血瓊脂平板上，37℃孵育24h后，挑選溶血的可疑菌落做進(jìn)一步鑒定。血液及腦脊液先在血清肉湯培養(yǎng)基中增菌后，接種到血瓊脂平板上分離培養(yǎng)并鑒定。

3.4肺炎鏈球菌的鑒定主要應(yīng)與甲型溶血性鏈球菌鑒別。其中以膽汁溶菌試驗、菊糖發(fā)酵和奧普托辛試驗最為常用。必要時可做小鼠毒力試驗。在上述試驗中，肺炎鏈球菌均為陽性，而 甲型溶血性鏈球菌為陰性。

4肺炎鏈球菌型別鑒定

4.1莢膜腫脹試驗 亦稱為Quellug試驗。新鮮標(biāo)本懸液與等量不稀釋的肺炎球菌分型診斷血清混合后，覆以蓋玻片，油鏡下觀察。標(biāo)本中肺炎球菌若與同型免疫血清相遇，莢膜將顯著增大。

4.2凝集試驗 將可疑肺炎球菌與已知標(biāo)準(zhǔn)分型血清做玻片凝集試驗，若細(xì)菌凝集成堆，為同型肺炎球菌。

5分子流行病學(xué)研究方法

近年來，由于傳統(tǒng)的細(xì)菌藥敏試驗和英膜血清學(xué)分型具有一定的局限性，分子流行病學(xué)研究方法被作為一種重要的補充手段用于肺炎鏈球菌感染和耐藥性的分析中。主要包括以下三個方面，①BOX-PCRP：它是肺炎鏈球菌染色體上的一段重復(fù)序列，呈現(xiàn)高度保守性，由三個亞單位組成，分別為A、B、C。其中以BOXA1為引物的 PCR 檢測法被廣泛應(yīng)用。②核酸分子雜交：該技術(shù)又被稱為核糖體分型。首先利用限制性內(nèi)切酶切割DNA，電泳后將DNA1轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，使其與被標(biāo)記的BOX片段進(jìn)行雜交，從而比較DNA片段的同源性。③限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）：該法與上法有類似之處，首先利用限制性內(nèi)切酶切割 DNA，經(jīng)電泳分離后，直接比較各菌株的 DNA 指紋，從而判斷其同源性[5]。

參考文獻(xiàn)：

[1]李杰，俞桑潔，揚水弘.肺炎鏈球菌疾病及其預(yù)防[J].中國計劃免疫， 2009，5（3）：176-179.

[2]陳軍，丁云芳，陶云珍.肺炎鏈球菌PBP1a、PBP2b基因突變分析[J].江蘇醫(yī)藥，2005，11（11）：34-36.

[3]糜祖煌，丁云芳.肺炎鏈球菌耐藥基因檢測[J].現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)，2003，7（07）：75-78.

[4]丁云芳，張建華，糜祖煌.兒童肺炎鏈球菌分離株青霉素、紅霉素耐藥性與耐藥相關(guān)基因研究[J].中華兒科雜志，2015，5（05）：29-31.

[5]丁云芳，糜祖煌，秦玲.肺炎鏈球菌β-內(nèi)酰胺酶TEM基因的發(fā)現(xiàn)[J].現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)，2012，12（12）：135-137.編輯/孫杰